シーケンス型 空間トランスクリプトーム：segmentation-free 解析 ─ 細胞を切らずに組織構造を読む

空間トランスクリプトーム解析（spatial transcriptomics）のうちシーケンス型（Visium・Stereo-seq など NGS で読み出す方式）は、サブセル解像度になると、1個の細胞が何十ものビンに割れます。ここまでの記事では、それを細胞に組み立て直す方法を見てきました。しかし組み立てには、核が写った画像と十分なカウントが要ります。どちらも揃わないとき、あるいは細胞の形が不規則で輪郭が引けないとき、そもそも細胞に切らないという選択肢があります。

1. なぜセグメンテーションをやめるのか

FICTURE の論文（Si et al., Nature Methods, 2024）は、問題をこう述べています。高解像度の空間データの解析は、画像ベースのセグメンテーションか格子への集約に強く依存しているが、細胞の大きさと形が多様で不規則な複雑な組織では、しばしば失敗する。

• 核染色の画像が無い、または品質が悪い：セグメンテーションの手がかりがない。
• 細胞の形が不規則：神経細胞の突起、筋線維、上皮の重なり。楕円に近い形を前提にしたモデルは、こうした細胞をうまく切れない。
• 1細胞あたりのカウントが薄い：切っても、発現プロファイルがノイズだらけになる。
• 誤差が下流すべてに伝わる：一度切ってしまうと、切り方の誤りはクラスタリングにもアノテーションにも波及する。

2. 返ってくるものが違う

ここが最も大きな違いです。セグメンテーションをすれば、行が細胞、列が遺伝子の行列が得られます。scRNA-seq と同じ形なので、そこから先の道具はすべて使えます。

segmentation-free では、細胞という行が存在しません。返ってくるのは、1ピクセルごとに因子や細胞型が塗られた地図です。

3. 2つの流派

segmentation-free と一口に言っても、考え方が2つに分かれます。参照を使わずに構造を発見するか、参照と照合して名前を付けるかです。

4. FICTURE ─ 参照なしで因子を見つける

FICTURE（Factor Inference of Cartographic Transcriptome at Ultra-high REsolution）は、多層ディリクレモデルを使って、ピクセル単位の空間因子を確率的変分推論で求めます。参照 scRNA-seq は要りません。

重要なのは、因子の推定が格子に縛られないことです。いったん集計用の単位で因子を学習したあと、推論そのものはピクセル単位で行われるので、組織の中の細胞の形に沿った構造が現れます。

bashコピー
# FICTURE は分子の座標表を入力に取る
#   必要な列：X  Y  gene  Count
head -n 3 transcripts.tsv
# X       Y       gene    Count
# 3120.5  8842.1  Snap25  2

pip install ficture

# 六角形の集計単位で因子を学習し、そのあとピクセル単位へ広げる
#   train-width : 学習に使う六角形の一辺（µm）
#   n-factor    : 因子の数。最初は多めにしてから減らす
ficture run_together \
    --in-tsv transcripts.tsv \
    --out-dir out_ficture \
    --mu-scale 1 \
    --major-axis Y \
    --train-width 12 \
    --n-factor 24

# 出力：ピクセルごとの因子と、因子ごとの上位遺伝子リスト

返ってくるのは番号のついた因子です。「因子3が何なのか」は、上位遺伝子を見て自分で判断します。

pythonコピー
import pandas as pd

# 因子ごとの上位遺伝子を見て、何を表しているのかを判断する
top = pd.read_csv("out_ficture/analysis/DE.tsv", sep="\t")
for fac, g in top.groupby("factor"):
    genes = g.nlargest(8, "gene_total")["gene"].tolist()
    print(fac, genes)

# ここで人が名前を付ける。自動では付かない
# 因子0 -> ['Snap25','Syt1',...]  神経細胞らしい
# 因子5 -> ['Mbp','Plp1',...]     オリゴデンドロサイトらしい

5. Sainsc ─ 参照と照合して名前を付ける

Sainsc（Müller-Bötticher et al., Small Methods, 2025）は、違うアプローチを取ります。

• カーネル密度推定（KDE）で、2次元の発現をならす。これでサブセル解像度に特有のスパース性が下がる。
• 参照シグネチャ（細胞型ごとの発現プロファイル）を用意する。既知のものでも、データ自身から作ったものでもよい。
• 各ピクセルの発現と参照シグネチャのコサイン類似度を取り、最も近い細胞型を割り当てる。
• 同時に割り当てスコアを計算し、その割り当てがどれだけ確からしいかを示す。

pythonコピー
import sainsc
import numpy as np

# 分子の座標表から GridCounts を作る
counts = sainsc.io.read_StereoSeq("cellbin_or_bin1.gem.gz")

# カーネル密度推定で、局所の発現をならす
#   ガウスカーネルは滑らか、Epanechnikov は端が切れる
kernel = sainsc.utils.gaussian_kernel(bw=8, truncate=2)
counts.calculate_total_mRNA_KDE(kernel)

# 参照シグネチャ（細胞型 × 遺伝子の平均発現）を渡す
#   参照 scRNA-seq から作ってもよいし、データ自身から作ってもよい
counts.assign_celltype(signatures=sig, kernel=kernel)

# 各ピクセルに細胞型と、その信頼度スコアが付く
print(counts.celltype_map.shape)
print(np.nanquantile(counts.assignment_score, [0.1, 0.5, 0.9]))

なお Sainsc は、100 の模擬データを使った評価で、セグメンテーションを前提とする手法や RCTD と比較され、割り当ての正確さと、スコアが高いほど正確になるという関係が示されています。

6. 使い分け

7. 結果をどう検証するか

segmentation-free の結果は、細胞という単位が無いので、これまでの記事で使ってきた「マーカーを UMAP に投影する」という検証がそのままは使えません。代わりに、次の3つを行います。

pythonコピー
import matplotlib.pyplot as plt

# 検証1：地図を組織像と重ねて、構造が一致するかを見る
fig, ax = plt.subplots(1, 2, figsize=(14, 7))
ax[0].imshow(he_image)
ax[1].imshow(counts.celltype_map)

# 検証2：信頼度スコアが低い領域を、そのまま地図にする
#   スコアが低い場所は、参照に無い型か、複数の型が混ざった境界
low = counts.assignment_score < np.nanquantile(counts.assignment_score, 0.2)
plt.imshow(low)

# 検証3：マーカー遺伝子の分布と、因子の分布を照合する
#   神経細胞の因子の場所に Snap25 が出ているか、を目で確かめる

• 地図を組織像と重ねる。因子や細胞型の分布が、組織学的な構造（層、腺管、血管、腫瘍巣）と一致するか。これが最も強い検証になる。
• 信頼度スコアの低い領域を地図にする。（Sainsc の場合）スコアが低い場所は、参照に無い型か、複数の型が混ざった境界。組織像と照らして、それが説明できるかを見る。
• マーカー遺伝子の分布と、因子の分布を照合する。神経細胞と判断した因子の場所に、実際に神経細胞のマーカーが出ているか。これは 細胞型アノテーションでマーカーを確認するのと同じ作業を、地図の上で行うということ。

8. 注意点 ─ 因子は細胞型と1対1ではない

もう1つ、覚えておくべきことがあります。segmentation-free は、セグメンテーションの代わりではありません。同じデータを両方の方法で見て、一致しない場所を探すのが実務的な使い方です。一致しない場所には理由があります。組織の境界か、セグメンテーションが苦手とする領域か、のどちらかです。

9. 判断のまとめ

まとめ

• 細胞の大きさと形が不規則な組織では、セグメンテーションはしばしば失敗する。そもそも切らないという選択肢がある。
• 返ってくるのは細胞のリストではなく、ピクセルの地図。セグメンテーション誤差は入らないが、細胞を数えることはできない。
• FICTURE は参照なしで因子を見つける。多層ディリクレモデル、格子に縛られないピクセル単位の推論、全転写産物・数十億座標に対応。ただし因子の名前は自分で付ける。
• Sainsc は KDE でならしてから参照シグネチャと照合する。細胞型名と信頼度スコアが返り、10 分未満で終わるので対話的に使える。
• 参照があるかどうかで選ぶ。順に使ってもよい。
• 検証は地図と組織像の重ね合わせが中心。スコアの低い領域とマーカーの分布も併せて見る。
• 因子は細胞型と1対1ではない。組織の状態や境界も因子になる。
• セグメンテーションの代わりではなく、もう一つの見方。両方で見て、一致しない場所を探す。

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参考文献

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