RNA-seq解析入門②：クオリティチェック編

📚 この記事について
解析の最初のステップです。データが信頼できるかを確認し、次にトリミングが必要かどうかを判断します。
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📌 前提：FASTQ ファイルが手元にあること（インストールはFastQC環境構築編）

RNA-seq（RNA sequencing）のクオリティチェックは、シーケンサーから得た生データが解析に使えるかを確認する工程です。ここでは FastQC・MultiQC・Falco の使い分けと、レポートの読み方を押さえます。

1. クオリティチェックのゴール
2. 3つのツールと使い分け
3. FastQC を動かす
4. レポートで見る3つの指標
5. 注意点
まとめ
複数サンプルをまとめて回すには
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参考文献

1. クオリティチェックのゴール

FASTQ ファイルには塩基配列と、各塩基の品質スコアが記録されています。しかしこのデータは常に完璧ではありません。

含まれうる問題は次の4つです。

品質の低い塩基：シーケンサーの読み取りエラーによるもの
アダプター配列の混入：シーケンス時に付加される人工配列
GC バイアス：塩基組成が偏っている状態
重複リード：同じ配列が異常に多く含まれる状態

これらを把握しないまま解析を進めると、誤った結論につながります。クオリティチェックの目的は、データが信頼できるかを確認し、次に何をすべきかを決めることです。

💡 用語：品質スコア（Phred スコア）
各塩基が正しく読めている確からしさを数値化したものです。Q20 は精度 99%、Q30 は精度 99.9% に相当し、一般に Q20 以上が合格ラインとされます。

💡 用語：アダプター配列
シーケンサーで DNA・RNA を読み取る際、技術的な理由から配列の端に付加される人工的な配列です。本来の配列ではないため、解析前に除去します。

2. 3つのツールと使い分け

ツール	開発言語	特徴
FastQC	Java	最も広く使われている定番。HTML レポートを出力
MultiQC	Python	複数サンプルの結果を1つのレポートに統合
Falco	C++	FastQC の高速版。出力に互換性がある

FastQC はクオリティチェックの事実上の標準です。情報量が多く、問題が起きたときに解決策を見つけやすいため、最初に学ぶツールとして適しています。

MultiQC は、FastQC の結果を複数サンプル分まとめて1つのレポートにします（Ewels et al., Bioinformatics, 2016）。サンプルが10個あれば FastQC 単体では10個の HTML を個別に開くことになりますが、MultiQC なら一覧で比較できます。サンプルが複数あるなら FastQC ＋ MultiQC が標準的な組み合わせです。

Falco は FastQC とほぼ同じ出力を、平均で約3倍高速に得られる C++ 実装です（de Sena Brandine & Smith, F1000Research, 2021）。出力形式に互換性があるため MultiQC とも併用できます。

状況	選択
はじめてクオリティチェックをする	FastQC
サンプルが複数ある	FastQC ＋ MultiQC
大規模データで速度を重視する	Falco

3. FastQC を動かす

FastQC にはコマンドラインと GUI の2つの起動方法があります。

方法①：コマンドライン

bash
# FASTQ を指定し、-o で出力先フォルダを指定する
fastqc sample.fastq.gz -o output_dir/

実行すると output_dir/ に HTML ファイルが生成されます。これをブラウザで開くとレポートを確認できます。スクリプトに組み込めるため、複数サンプルの一括処理に向いています。

方法②：GUI

bash
# 引数なしで実行すると GUI が起動する
fastqc

「File」→「Open」から FASTQ を選んで解析できます。コマンドに不慣れな段階や、動作確認に向いています。

4. レポートで見る3つの指標

FastQC のレポートには多くの項目がありますが、まず次の3つを確認します。

① Per base sequence quality（塩基ごとの品質）
各塩基位置での品質スコアの分布です。緑（Q28 以上）が高品質、黄（Q20〜28）が許容範囲、赤（Q20 未満）が要注意です。リード末端に向かって品質が下がるのは正常な傾向ですが、末端が著しく低い場合はトリミングで除去します。

② Adapter Content（アダプターの混入）
アダプター配列の混入率です。グラフが右側に向かって上昇していれば混入があり、トリミングが必要です。凡例を見ると、どのアダプターが混入しているかが分かります。この配列を次のトリミングで指定します。

③ Per sequence GC content（GC 含量）
サンプル全体の GC 含量の分布です。理想的には釣り鐘型になります。大きく歪む場合は汚染や偏りが疑われます。ただし特殊な条件下のシーケンスでは偏ることもあるため、自分の実験系に照らして解釈します。

5. 注意点

警告（黄・赤）＝失敗ではない：FastQC の判定は一般的な基準に基づくもので、実験系によっては正常でも警告が出ます。指標の意味を理解した上で判断します。
納品データはすでにトリミング済みのことがある：受託解析の FASTQ は前処理済みの場合があります。まず FastQC で確認し、必要な工程だけ行います。
トリミング後にもう一度実行する：処理で問題が取り除けたかを、同じ指標で確認します。

まとめ

クオリティチェックは、データが信頼できるかを確認し次の行動を決めるステップ。
基本は FastQC。複数サンプルなら MultiQC、大規模データなら Falco。
レポートでは品質スコア・アダプター混入・GC 含量の3つをまず確認する。

複数サンプルをまとめて回すには

FastQC は1サンプルなら GUI でも動かせますが、実際の解析では数十本の FASTQ をまとめて処理することになります。そこで必要になるのが、ワイルドカードでファイルをまとめて指定する、for 文でループを回す、出力先ディレクトリを用意する、といったシェルの操作です。MultiQC でレポートを束ねる工程も同じで、ツールの使い方そのものより、その周辺のファイル操作でつまずくことのほうが多くなります。

『生命科学データ解析をはじめる前に読む本』は、まさにこの層を扱っています。公共データベースからデータを取得し、壊れていないか確認し、目的に応じて加工・集計するという一連の流れを、Linux コマンドを打ちながら学ぶ構成です。FASTQ のような大きなテキストファイルを扱う場面で、そのまま効いてきます。

生命科学データ解析をはじめる前に読む本（実験医学別冊）

羊土社・2026年5月／3,960円（税込）。清水秀幸／著。Linux コマンドの基本から、公共データベースからのデータ取得、gzip による圧縮・解凍、cut・sort・uniq をパイプでつないだ集計、解析環境の構築、スパコンの利用方法までを扱う。文字列処理やファイルの読み書きの章もある。

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参考文献

Andrews, S. (2010). FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. Babraham Bioinformatics.
Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., & Käller, M. (2016). MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics, 32(19), 3047–3048. doi:10.1093/bioinformatics/btw354
de Sena Brandine, G., & Smith, A. D. (2021). Falco: high-speed FastQC emulation for quality control of sequencing data. F1000Research, 8, 1874. doi:10.12688/f1000research.21142.2