scRNA-seq解析：サンプル統合とバッチ補正 ― Harmony（GPU不要の古典的手法）

🎯 この記事の結論

• やること：複数サンプルの「測定のクセ（バッチ効果）」だけを消し、本物の生物差は残す
• 必ず守る1つ：近傍グラフで use_rep="X_pca_harmony" を指定（＝補正結果を“使う”）
• 注意：消しすぎ（過補正）に注意。Harmony が直すのは埋め込みで、発現量そのものではない

この記事のゴール

複数サンプルをまたいで、「測定のクセ（バッチ効果）」だけを消し、本物の生物学的な違いは残したデータを、軽量・普通のPCで動く Harmony で作ること。

0. バッチ効果ってなに？ なぜ補正するの？

同じ細胞型でも、測定した日・試薬のロット・10x のチップなどが違うと、発現のパターンが系統的にずれます。これがバッチ効果です。

補正しないとどうなるか？ 次元削減やクラスタリングで、「細胞型」ではなく「サンプル」でグループが割れてしまい、解釈が壊れます。

1. 準備：正規化・特徴選択（HVG）

統合の前に、共通の前処理をします。ここでは、細胞ごとに発現が大きく変動する遺伝子だけに絞る高変動遺伝子（HVG、highly variable genes＝高変動遺伝子）選択を行います。seurat_v3 という方法は生（なま）のカウントを必要とするので、先に生カウントを別の場所へ退避してから選びます。

pythonコピーimport numpy as np
import scanpy as sc
import anndata as ad

# combined: 前の記事（QC）で得たクリーンな AnnData（obs["batch"] にサンプル/群ラベル）
adata = combined.copy()

# 生カウントを保存（seurat_v3 は生カウントを要求するため）
adata.layers["counts"] = adata.X.copy()

# HVG を「生カウント」から seurat_v3 で選択（バッチ考慮）
sc.pp.highly_variable_genes(
    adata,
    n_top_genes=2000,
    flavor="seurat_v3",
    layer="counts",
    batch_key="batch",
    subset=False,
)

2. Harmony で統合する

仕組み（やさしく）

Harmony は 主成分分析（PCA、principal component analysis：情報を圧縮して扱いやすくする手法）の空間で動きます。やっていることはシンプルで、

1. 似た細胞をゆるくグループ分けし、
2. 各グループの中で「サンプル（バッチ）ごとの偏り」を打ち消し、
3. これを何度か繰り返してバッチ差をそろえる、

というものです（Korsunsky et al., 2019）。深層学習を使わない軽量・高速で、普通のPCで十分な方法です。

コード（正規化 → PCA → Harmony → 近傍 → クラスタリング）

まず正規化（公平に比較できるよう数値をそろえる）と対数変換をして、HVG に絞って PCA をかけます。

pythonコピーimport scanpy as sc

# 正規化と対数変換
sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4)
sc.pp.log1p(adata)
adata.raw = adata                       # 全遺伝子の正規化済みデータを退避

# HVG に絞ってスケーリング → PCA
adata_h = adata[:, adata.var.highly_variable].copy()
sc.pp.scale(adata_h, max_value=10)
sc.tl.pca(adata_h, n_comps=30)

次に Harmony を適用します。

pythonコピーimport harmonypy

def harmony_integrate_robust(adata, batch_key, basis="X_pca", adjusted="X_pca_harmony"):
    ho = harmonypy.run_harmony(adata.obsm[basis], adata.obs, [batch_key])
    Z = ho.Z_corr
    if Z.shape[0] != adata.n_obs:        # 古い向き (PCs, cells) の場合は転置
        Z = Z.T
    adata.obsm[adjusted] = np.asarray(Z) # → (細胞数, PC数) で格納
    return adata

harmony_integrate_robust(adata_h, "batch")   # obsm["X_pca_harmony"] が作られる

# ★ 補正後の埋め込みで近傍グラフを作る（ここが最重要）
sc.pp.neighbors(adata_h, use_rep="X_pca_harmony", n_neighbors=15)
sc.tl.umap(adata_h)
sc.tl.leiden(adata_h, key_added="leiden_harmony",
             flavor="igraph", n_iterations=2, directed=False, resolution=1.0)

sc.pl.umap(adata_h, color=["batch", "leiden_harmony"], ncols=2, frameon=False)

3. 統合できたかを評価する（消しすぎていないか）

「UMAP（uniform manifold approximation and projection：高次元データを2次元に配置する手法）できれいに重なった」だけでは不十分です。確認するのは2点：「同じ細胞型はサンプルをまたいで重なったか（バッチ差は消えたか）」と「違う細胞型の違いは残ったか（消しすぎていないか）」です。

pythonコピー# ① バッチが混ざっているか（混ざっていれば技術差は除けている）
sc.pl.umap(adata_h, color="batch", frameon=False)

# ② 既知マーカーで細胞型が保たれているか（消えていないか）
known_markers = ["GeneA", "GeneB", "GeneC"]   # 自分の系のマーカーに置換
sc.pl.umap(adata_h, color=known_markers, color_map="RdBu_r", frameon=False)

4. もう一方の選択肢：AI 手法の scVI（GPU 必須）

統合にはもう一つ、深層学習ベースの scVI という選択肢があります（詳細は別記事 サンプル統合：scVI（GPU必須のAI手法） で解説）。強いバッチ効果や大規模データに強く、この後のダブレット検出（SOLO）・アノテーション・マルチモーダル解析へ発展させやすい一方、実用上 GPU が必須です。

⚠️ つまずきポイントまとめ

• use_rep="X_pca_harmony" の指定忘れ（最重要）→ 補正が反映されず、サンプルで割れる。
• Harmony は埋め込みを補正するだけ → 発現量を使う解析（DEG 等）は元の正規化発現を使う。
• harmonypy 2.0 の向き問題 → run_harmony を直接呼ぶ堅牢版で回避。
• regress_out を入れない（今は既定で非推奨）。
• 過補正（消しすぎ） → 「重なった＝成功」ではない。必ず評価する。

まとめ

• 統合のゴールは「バッチ差を消し、生物学的な違いは残す」の両立。消しすぎ（過補正）に注意し、必ず評価する。
• Harmony は軽量・普通のPCで完結。ポイントは3つ：neighbors で use_rep="X_pca_harmony" を必ず指定／補正されるのは埋め込み（発現量解析は元の発現を使う）／regress_out は使わない。
• GPU が使え、強いバッチ・大規模・発展性を求めるなら scVI（別記事） を検討。

次の記事：ダブレットの検出 ― scrublet（GPU不要） — 2細胞が1つに化けた人工物を、普通のPCで完結する古典的手法で検出・除去します。

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参考文献

• Korsunsky, I., Millard, N., Fan, J., et al. (2019). Fast, sensitive and accurate integration of single-cell data with Harmony. Nature Methods, 16, 1289–1296. doi:10.1038/s41592-019-0619-0
• Luecken, M. D., Büttner, M., Chaichoompu, K., et al. (2022). Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nature Methods, 19, 41–50. doi:10.1038/s41592-021-01336-8
• Heumos, L., Schaar, A. C., Lance, C., et al. (2023). Best practices for single-cell analysis across modalities. Nature Reviews Genetics, 24, 550–572. doi:10.1038/s41576-023-00586-w
• Single-cell best practices（統合の章）: https://www.sc-best-practices.org/cellular_structure/integration.html