イメージング型空間トランスクリプトーム：細胞レベルの QC と正規化 ─ 切り方の痕跡をどこまで消すか

📚 この記事について
セグメンテーションが済んだあとの工程を扱います。面積という指標をどう使うのか、正規化で何が消えるのか、パネルが小さいときに特徴選択をどう考えるのかを整理します。これで前処理は完結します。
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📌 前提：scRNA-seq解析：データの読み込みと品質管理（QC）／セグメンテーション手法の選び方

空間トランスクリプトーム解析（spatial transcriptomics）のうちイメージング型（Xenium・CosMx・MERSCOPE など顕微鏡で1分子ずつ数える方式）は、細胞に切ったあとの QC が、scRNA-seq とは違う意味を持ちます。細胞の分子数が少ないとき、それは発現が低い細胞かもしれませんし、切り方が悪くて取りこぼした細胞かもしれません。この2つを区別できないまま先に進むと、計算の産物を生物学として解釈することになります。

1. 3つの指標を作る
2. 面積と分子数を、組で読む
3. 落とす基準を決める
4. 正規化 ─ 何を消して何を残すか
5. 特徴選択 ─ パネルはすでに選び抜かれている
6. クラスタリングの解像度
7. 複数スライドの統合
8. 前処理完了チェック
まとめ
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参考文献

1. 3つの指標を作る

計算する指標は scRNA-seq の QCに近いのですが、面積と、そこから作る面積あたりの分子数が加わります。

python
import scanpy as sc
import squidpy as sq
import numpy as np

adata = sdata["table"].copy()
adata.layers["counts"] = adata.X.copy()
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, inplace=True, log1p=False)

# 3つ目の指標をここで作る
adata.obs["density"] = (
    adata.obs["total_counts"] / adata.obs["cell_area"]
)

# 分布を見てから閾値を決める。先に決めない
for col in ["total_counts", "cell_area", "density"]:
    q = np.percentile(adata.obs[col], [1, 5, 25, 50, 75, 95, 99])
    print(col, np.round(q, 2))

指標	何を表すか
細胞あたりの分子数	その細胞から回収できた量
細胞の面積	セグメンテーションが引いた輪郭の大きさ
面積あたりの分子数	切り方の良し悪しがここに出る

2. 面積と分子数を、組で読む

分子数だけを見ると、「少ない細胞」は1つの集団に見えます。しかし面積と組で見ると、まったく違う2つが混ざっていることが分かります。

面積	分子数	解釈	対応
小さい	多い	核だけ取れている（濃い）	広げ方を見直す
大きい	多い	正常、または複数細胞の融合	純度で見分ける
小さい	少ない	取りこぼし	落とす候補
大きい	少ない	広げすぎ	落とす候補

python
# 面積と分子数の組み合わせで、細胞を4つに分ける
med_a = np.median(adata.obs["cell_area"])
med_c = np.median(adata.obs["total_counts"])

big  = adata.obs["cell_area"] > med_a
rich = adata.obs["total_counts"] > med_c
adata.obs["quad"] = np.select(
    [~big & rich, big & rich, ~big & ~rich, big & ~rich],
    ["小さいが濃い", "大きく濃い", "小さく薄い", "大きいが薄い"],
)
print(adata.obs["quad"].value_counts())

# 組織の上に描くと、どこで切り方が崩れているかが見える
sq.pl.spatial_scatter(adata, color="quad", shape=None)

💡 組織の上に描くと、原因が場所で分かる
4つの分類を組織の上に描いてください。「広げすぎ」の細胞が特定の領域に固まっているなら、そこは細胞がまばらな領域か、核染色が弱かった領域です。全体に散らばっているなら、パラメータの問題です。場所の情報があるからこそ、原因まで辿れます。

3. 落とす基準を決める

python
# 落とす候補は2つ。どちらも「切り方が悪い」側
drop_thin = (adata.obs["cell_area"] > np.quantile(adata.obs["cell_area"], 0.9)) & \
            (adata.obs["density"] < np.quantile(adata.obs["density"], 0.1))
drop_low  = adata.obs["total_counts"] < 10

print("広げすぎ:", int(drop_thin.sum()), "／ 分子不足:", int(drop_low.sum()))
adata = adata[~(drop_thin | drop_low)].copy()

# 落とした細胞が、組織のどこにあったかを確認する
#   ひとかたまりで消えているなら、その領域は撮像に問題があった可能性

⚠️ 落とした細胞が、どこにあったかを必ず見る
細胞をひとかたまりで落としたなら、それは領域ごと壊れていたということです。その原因は、転写産物レベルの QCで扱った撮像の問題であることが多い。本来は切る前に、分子の段階でその領域を外しておくべきでした。今回は落として進めるとしても、次のサンプルでは分子の段階で確認してください。

⚠️ 排他的マーカーを併せ持つ細胞に印を付ける
2つの細胞を1つにまとめてしまった細胞は、同居しないはずのマーカーを同時に持ちます。scRNA-seq のダブレットと見かけは似ていますが、原因が違います。ここでは計算由来なので、落とすだけでなくセグメンテーションを見直す材料にもなります。そういう細胞が多いなら、セグメンテーションの段階に戻る判断もありえます。

4. 正規化 ─ 何を消して何を残すか

やり方	得られるもの	失うもの
総分子数で割る（既定）	切り方の影響が消える	細胞の大きさも消える
面積で割る	大きさの影響が消える	小さい細胞が過大評価されうる
割らない	情報を失わない	細胞の大きさがそのまま効く

python
# 選択肢を3つとも作って、比べられるようにしておく
adata.layers["by_counts"] = adata.X.copy()
sc.pp.normalize_total(adata)
sc.pp.log1p(adata)
adata.layers["by_counts"] = adata.X.copy()

# 面積で割る版
Xa = adata.layers["counts"].copy().astype(float)
area = adata.obs["cell_area"].to_numpy()[:, None]
Xa = Xa / area * np.median(area)
adata.layers["by_area"] = np.log1p(Xa)

# どちらでクラスタリングするかを、組織像と照らして決める
# 面積は obs に残しておく。正規化で消える情報だから

💡 細胞の大きさは、生物学でもあり計算の産物でもある
同じ細胞型でも、活性化した細胞は大きくなります。これは生物学です。一方、輪郭を広げれば面積は増えます。これは計算の産物です。この2つが同じ数字に混ざっているので、「消すべきか残すべきか」に一般解がありません。だから面積を obs に残し、あとから選び直せるようにしておきます。クラスタごとに面積の分布を比べれば、影響の大きさが見積もれます。

5. 特徴選択 ─ パネルはすでに選び抜かれている

高変動遺伝子の選択は、捨ててよい遺伝子があることを前提にしています。全転写産物のデータには、確かに情報を持たない遺伝子がたくさんあります。

しかしパネルは違います。設計の段階で、情報を持つ遺伝子だけが選ばれています。300 遺伝子のパネルからさらに 2,000 を選ぼうとしても、そもそも足りません。絞れば、信号を捨てることになりかねません。

python
# パネルの大きさによって、特徴選択の考え方が変わる
n_genes = adata.n_vars
print("パネルの遺伝子数:", n_genes)

if n_genes < 500:
    # 選び抜かれた小さなパネル。絞る余地がほとんど無い
    use = adata.var_names.tolist()
else:
    sc.pp.highly_variable_genes(adata, n_top_genes=min(2000, n_genes))
    use = adata.var_names[adata.var["highly_variable"]].tolist()

print("使う遺伝子:", len(use))

# 迷ったら、両方でクラスタリングして組織像と比べる
sc.pp.pca(adata, n_comps=min(50, len(use) - 1))
sc.pp.neighbors(adata)
sc.tl.leiden(adata, resolution=1.0, flavor="igraph")
sq.pl.spatial_scatter(adata, color="leiden", shape=None)

💡 迷ったら、両方でクラスタリングして比べる
絞った場合と絞らない場合の両方でクラスタリングし、組織像とよく合うほうを選べば済みます。空間データには「組織像」という外部の基準があるので、この比較ができます。scRNA-seq のクラスタリングでは、こうした外部基準がないぶん判断が難しくなります。

6. クラスタリングの解像度

解像度を1つに決めず、いくつか振って組織像と見比べます。「クラスタ数がいくつなら正しい」という基準はありません。組織のどの構造を分けたいのかで決めます。

⚠️ 細かく分けるほど良いわけではない
解像度を上げれば、クラスタは細かく分かれます。しかし、その細分がパネルの遺伝子で支えられているかは別の問題です。分ける根拠がパネルに無ければ、その境界はノイズで決まります。この点はパネル制約下でのアノテーションで詳しく扱います。

7. 複数スライドの統合

スライド間の差は Harmony や scVI で補正できます。道具立ては scRNA-seq と同じです。

⚠️ 3つの原因を切り分けてから統合する
スライドによって細胞あたりの分子数が違うとき、原因は3つ考えられます。(1) 実験のばらつき、(2) セグメンテーションの出来の差、(3) 検出感度そのものの差。バッチ補正で直るのは (1) だけです。(2) なら切り方をそろえるべきですし、(3) なら統合せず別々に解析するほうが安全なこともあります。面積・面積あたりの分子数・対照の率をスライドごとに比べて、どれなのかを先に見分けてください。

パネルが違うデータを比べる場合は、さらに注意が要ります。パネルの拡大が検出効率を下げうることが報告されており（Cervilla et al., Genome Biology, 2026）、共通遺伝子だけに絞っても、1遺伝子あたりの検出量が違う可能性があります。

8. 前処理完了チェック

面積と面積あたりの分子数を計算したか
面積と分子数を組で見て、4つに分類したか
落とした細胞が組織のどこにあったかを確認したか
排他的マーカーを併せ持つ細胞に印を付けたか
生カウントを layers に残したか
面積を obs に残したか
正規化の選択肢を複数作って、比べられるようにしたか
パネルの大きさに対して、特徴選択の方針は妥当か
クラスタを組織の上に描いて、構造と対応するか確認したか
スライド間の差の原因を切り分けたか

まとめ

分子数が少ない細胞は、発現が低い細胞か切り方が悪い細胞か。面積と組で見ないと区別できない。
大きいのに薄い細胞は、広げすぎ。小さくて薄い細胞は、取りこぼし。どちらも落とす候補。
落とした細胞の場所を見る。かたまっているなら、領域ごと壊れていた。
正規化は総分子数・面積・割らないの3択。総分子数で割ると、切り方と一緒に細胞の大きさも消える。
細胞の大きさは生物学でもあり計算の産物でもあるので、一般解が無い。面積を obs に残して、あとから選び直せるようにする。
パネルはすでに選び抜かれている。高変動遺伝子の選択は「捨ててよい遺伝子がある」前提に立つが、小さなパネルではその前提が崩れる。
空間データには組織像という外部基準がある。迷ったら両方試して比べればよい。
スライド間の差は実験・切り方・感度の3つに切り分ける。バッチ補正で直るのは1つ目だけ。

イメージング型空間トランスクリプトーム：セグメンテーション手法の選び方
イメージング型空間トランスクリプトーム：転写産物レベルの QC
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イメージング型空間トランスクリプトーム：前処理の全体像
scRNA-seq解析：データの読み込みと品質管理（QC）
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scRNA-seq解析：サンプル統合とバッチ補正 ─ Harmony
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参考文献

Petukhov, V., Xu, R. J., Soldatov, R. A., et al. (2022). Cell segmentation in imaging-based spatial transcriptomics. Nature Biotechnology, 40(3), 345–354. doi:10.1038/s41587-021-01044-w
Cervilla, S., Grases, D., Perez, E., et al. (2026). A technical comparison of spatial transcriptomics platforms across six cancer types. Genome Biology, 27, 22. doi:10.1186/s13059-026-03937-y
Janesick, A., Shelansky, R., Gottscho, A. D., et al. (2023). High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nature Communications, 14(1), 8353. doi:10.1038/s41467-023-43458-x
Wolf, F. A., Angerer, P., & Theis, F. J. (2018). SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biology, 19, 15. doi:10.1186/s13059-017-1382-0
Traag, V. A., Waltman, L., & van Eck, N. J. (2019). From Louvain to Leiden: guaranteeing well-connected communities. Scientific Reports, 9, 5233. doi:10.1038/s41598-019-41695-z
Korsunsky, I., Millard, N., Fan, J., et al. (2019). Fast, sensitive and accurate integration of single-cell data with Harmony. Nature Methods, 16(12), 1289–1296. doi:10.1038/s41592-019-0619-0
Palla, G., Spitzer, H., Klein, M., et al. (2022). Squidpy: a scalable framework for spatial omics analysis. Nature Methods, 19(2), 171–178. doi:10.1038/s41592-021-01358-2
Marconato, L., Palla, G., Yamauchi, K. A., et al. (2025). SpatialData: an open and universal data framework for spatial omics. Nature Methods, 22(1), 58–62. doi:10.1038/s41592-024-02212-x