scRNA-seq解析：正規化・特徴選択・次元削減・クラスタリング

この記事のゴール

QC を通したきれいなデータから、「細胞のグループ（クラスタ）」を見つけるところまでを、4ステップで実行できるようになること。各ステップで「何のために」を押さえ、代表的な選択肢と典型的な誤りも整理します。

全体の流れ（まずここを押さえる）

4ステップは、次の順番でデータを変換していきます。ここで一番こんがらがるのは「PCA」と「UMAP」の役割の違いなので、先に全体像で整理します。

ポイントは2つです。

• PCA は解析の土台（近傍グラフ・クラスタリング・UMAP すべての入力）。
• UMAP は可視化専用。クラスタリングは UMAP の2D座標ではなく、近傍グラフ（＝PCA空間）の上で行います。

1. 正規化（Normalization）

なぜ必要か

細胞ごとに、検出された総 mRNA 分子数（シーケンス深度）が大きく違います。この違いの多くは技術的要因（捕捉効率・PCR・シーケンス量）で、生物学的な発現差ではありません。揃えないと「深く読まれた細胞＝高発現」という偽の差が生まれます。

基本のコード（shifted log）

最も標準的なのが shifted log（深度を揃えて log を取る）です。本シリーズもこれを既定にします。

pythonコピーimport scanpy as sc
# adata: ダブレット除去済み。生カウントは adata.layers["counts"] に退避済み

sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4)   # 各細胞の総カウントを 1e4 に揃える（CP10K）
sc.pp.log1p(adata)                             # log(1 + x) で分散を安定化

代表的な手法（迷ったら shifted log）

2. 特徴選択（Highly Variable Genes, HVG）

なぜ必要か

数万ある遺伝子の大半は、細胞間でほぼ一定です。一定の遺伝子は構造の手がかりにならず、ノイズと計算量を増やすだけです。変動の大きい遺伝子（HVG）だけに絞ると、細胞集団の構造が見えやすくなり、計算も軽くなります。

基本のコード（分散ベース）

pythonコピー# 変動の大きい遺伝子を分散ベース（seurat flavor）で選ぶ
sc.pp.highly_variable_genes(adata, min_mean=0.0125, max_mean=3, min_disp=0.5)
sc.pl.highly_variable_genes(adata)             # 選ばれた遺伝子を確認

adata.raw = adata                              # 正規化済みの全遺伝子を退避（後で DEG 等に使う）
adata = adata[:, adata.var.highly_variable].copy()   # HVG だけにスライス

flavor（選択アルゴリズム）の比較

flavor と「入力データの種類」の対応を間違えないことが最重要です。

3. 次元削減（Dimensionality Reduction）

ここは役割の違う2段階を混同しないことが最重要です（冒頭の図を再確認）。

3-1. PCA（線形）— 解析の土台

PCA はノイズを落として主要な変動軸（主成分）に圧縮します。近傍グラフ・クラスタリング・UMAP の入力になる、解析の土台です。

pythonコピー# （任意）技術ノイズの影響を回帰で除く
sc.pp.regress_out(adata, ["total_counts", "pct_counts_mt"])

sc.tl.pca(adata, n_comps=50, svd_solver="arpack")   # 主成分に圧縮
sc.pl.pca_variance_ratio(adata, log=True)           # 何 PC 使うかの目安

3-2. UMAP / t-SNE（非線形）— 可視化「専用」

UMAP（McInnes et al., 2018）は、高次元の構造を2Dに落として見るためのものです。

pythonコピーsc.pp.neighbors(adata, n_neighbors=15, n_pcs=50)   # PCA 空間で近傍グラフを作る
sc.tl.umap(adata)
sc.pl.umap(adata, color="leiden")

4. クラスタリング（Clustering）

Leiden を使う（Louvain ではなく）

現在の標準はグラフベースの Leiden 法です。近傍グラフ上で「密につながった細胞のかたまり」を見つけます。かつて広く使われた Louvain 法には、まれに内部がつながっていない（disconnected）クラスタを作る欠陥があり、Leiden はこれを解消して連結性を保証します（Traag et al., 2019）。

pythonコピーsc.tl.leiden(
    adata, key_added="leiden",
    flavor="igraph", n_iterations=2, directed=False,   # 現行の推奨指定
    resolution=1.0,
)
sc.pl.umap(adata, color="leiden")

resolution は「粒度のつまみ」

resolution を上げるとクラスタは細かく（多く）なり、下げると粗く（少なく）なります。唯一の正解はありません。

pythonコピー# 複数の解像度で試し、安定する粒度を選ぶ
for res in [0.3, 0.5, 0.8, 1.0]:
    sc.tl.leiden(adata, key_added=f"leiden_r{res}",
                 flavor="igraph", n_iterations=2, directed=False, resolution=res)

全体を通したコード

ここまでを1つの関数にまとめると、次のようになります（統合が必要なら PCA の後に Harmony / scVI を挟みます）。

pythonコピーimport scanpy as sc

def standard_preprocess(adata, n_pcs=50, n_neighbors=15, resolution=1.0, random_state=0):
    """正規化 → HVG → 回帰 → PCA → 近傍グラフ → UMAP → Leiden を通しで実行して返す。"""
    # 1. 正規化（shifted log）
    sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4)
    sc.pp.log1p(adata)

    # 2. 高変動遺伝子（HVG, 分散ベース）→ raw に退避 → HVG だけにスライス
    sc.pp.highly_variable_genes(adata, min_mean=0.0125, max_mean=3, min_disp=0.5)
    adata.raw = adata
    adata = adata[:, adata.var.highly_variable].copy()

    # 3. 技術ノイズの回帰（任意）→ PCA
    sc.pp.regress_out(adata, ["total_counts", "pct_counts_mt"])
    sc.tl.pca(adata, n_comps=n_pcs, svd_solver="arpack")
    # 統合する場合はここで：sc.external.pp.harmony_integrate(adata, "batch")

    # 4. 近傍グラフ → UMAP → Leiden
    sc.pp.neighbors(adata, n_neighbors=n_neighbors, n_pcs=n_pcs)
    sc.tl.umap(adata, random_state=random_state)
    sc.tl.leiden(adata, key_added="leiden", flavor="igraph",
                 n_iterations=2, directed=False, resolution=resolution)
    return adata

adata = standard_preprocess(adata)
sc.pl.umap(adata, color="leiden")

この関数のなかで実際に起きているのは、AnnData に対する列の追加とスライスです。とくに adata.raw = adata と adata[:, adata.var.highly_variable] の2行は、何を退避して何を捨てているのかが分かれ目になります。ここが曖昧なまま進むと、後の差次的発現解析で「HVG に絞った後の遺伝子しか見えない」といった形で跳ね返ってきます。

本記事で繰り返した「flavor と入力データの対応を間違えない」という注意点も、突き詰めれば adata.X と adata.layers["counts"] のどちらを渡しているかという pandas と NumPy の話です。この層をきちんと踏みたい場合は、『改訂 独習Pythonバイオ情報解析』が、NumPy の配列と pandas の DataFrame を土台から扱ったうえで Scanpy に進む構成になっています。関数を呼ぶだけの状態から、引数の意味とデータへの副作用を判断できる状態に移りたい段階に向いています。

改訂 独習Pythonバイオ情報解析（実験医学別冊）

羊土社・2025年1月／7,150円（税込）。NumPy による数値配列の扱いと pandas による表データの操作を基礎から解説したうえで、Scanpy を用いたシングルセル解析へ進む構成。改訂版で Scanpy の解説が加筆されている。

※上記リンクはアフィリエイト広告（PR）です

つまずきやすいポイント（まとめ）

• 正規化：既定は shifted log。希少細胞型狙いなら Pearson residuals。scVI には生カウントを渡す。
• HVG：flavor と入力データ（生 vs 正規化済み）の対応に注意。seurat は正規化後、seurat_v3 / pearson_residuals は生カウント。
• 次元削減：PCA は解析の土台、UMAP は可視化専用。UMAP の距離・配置を定量解釈しない。クラスタリングは近傍グラフ上で行う。
• クラスタリング：Leiden（flavor="igraph"）。resolution は粒度のつまみで、クラスタ数は真実ではない。

次の記事：細胞型アノテーション（マーカー遺伝子の同定） — 得られたクラスタに意味を与えます。マーカー遺伝子の同定から始める細胞型アノテーションを扱います。

関連記事

• 📖 scRNA-seqの前処理 入門 ─ 全体像と進め方 … このシリーズの全体像（ハブ）
• 📖 データの読み込みと品質管理（QC） ／ 📖 ダブレット検出（scrublet・SOLO）… 本記事の前段
• 📖 サンプル統合（Harmony・scVI）… 複数サンプルを扱う場合は PCA の後に
• 📖 細胞型アノテーション手法の全体像 ／ 📖 手動アノテーション（マーカー遺伝子の同定） … 次の段階
• 📖 AnnDataのデータ構造 ／ 📖 scvi-tools の全体像 … 土台・AI手法の地図

参考文献

• Ahlmann-Eltze, C., & Huber, W. (2023). Comparison of transformations for single-cell RNA-seq data. Nature Methods, 20, 665–672. doi:10.1038/s41592-023-01814-1
• Lause, J., Berens, P., & Kobak, D. (2021). Analytic Pearson residuals for normalization of single-cell RNA-seq UMI data. Genome Biology, 22, 258. doi:10.1186/s13059-021-02451-7
• Traag, V. A., Waltman, L., & van Eck, N. J. (2019). From Louvain to Leiden: guaranteeing well-connected communities. Scientific Reports, 9, 5233. doi:10.1038/s41598-019-41695-z
• McInnes, L., Healy, J., & Melville, J. (2018). UMAP: Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction. arXiv:1802.03426
• Chari, T., & Pachter, L. (2023). The specious art of single-cell genomics. PLOS Computational Biology, 19(8), e1011288. doi:10.1371/journal.pcbi.1011288
• Heumos, L., Schaar, A. C., Lance, C., et al. (2023). Best practices for single-cell analysis across modalities. Nature Reviews Genetics, 24, 550–572. doi:10.1038/s41576-023-00586-w