RNA-seq解析入門⑤：カウント編

📚 この記事について
遺伝子ごとのリード数を集計し、発現変動解析の入力となるカウントマトリクスを作ります。
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📌 前提：STAR などで出力したソート済み BAM と、マッピング時と同じ GTF があること

RNA-seq（RNA sequencing）のカウント（定量）は、各遺伝子に何本のリードが対応するかを数える工程です。ここでは2つの方式の違いと、HTSeq-count の実践的な使い方を押さえます。

1. カウントのゴール
2. 2つの方式
3. 4つのツールと使い分け
4. HTSeq-count の使い方
5. 注意点
カウント表をこの先どう扱うか
まとめ
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参考文献

1. カウントのゴール

マッピングでリードをゲノム上に貼り合わせたら、次は各遺伝子に何本のリードが重なっているかを数えます。この数値が大きいほど、その遺伝子がよく発現していたことを意味します。

結果はカウントマトリクス（行＝遺伝子、列＝サンプル）として出力され、次の発現変動解析の入力になります。

2. 2つの方式

カウントの方法は大きく2つに分かれます。

BAM ベースは、マッピング済みの BAM を入力にします（featureCounts・HTSeq-count）。中間ファイルを確認できるのが利点です。

アラインメントフリーは、マッピングを行わず FASTQ から直接定量します（Salmon・kallisto）。処理が非常に速い一方、BAM が残らないため中間の確認はできません。

本シリーズは BAM ベース（STAR → HTSeq-count）の流れで解説します。

3. 4つのツールと使い分け

ツール	方式	特徴
featureCounts	BAM ベース	C 実装で高速。複数サンプルを一括処理できる
HTSeq-count	BAM ベース	Python 製。コマンドがシンプルだが処理は遅い
Salmon	アラインメントフリー	超高速。バイアス補正が充実
kallisto	アラインメントフリー	超高速・省メモリ

featureCounts は Subread パッケージのツールで、C 実装のため非常に高速です（Liao et al., Bioinformatics, 2014）。数十サンプルの一括処理に向いています。

HTSeq-count は Python 製で、コマンドがシンプルなため挙動を追いやすいツールです（Putri et al., Bioinformatics, 2022）。処理は featureCounts より遅いため、大規模データには不向きです。

Salmon は FASTQ から直接トランスクリプトの発現量を推定し、バイアス補正も充実しています（Patro et al., Nature Methods, 2017）。tximport 経由で DESeq2 に渡す流れが標準化しつつあります。

kallisto は擬似アライメント（pseudo-alignment）により、軽量・高速に定量します（Bray et al., Nature Biotechnology, 2016）。メモリが限られた環境に向いています。

状況	選択
はじめてカウントをする	HTSeq-count
大量サンプルを BAM から速く処理したい	featureCounts
マッピングを省いて高速に定量したい	Salmon
メモリが少ない環境で高速に定量したい	kallisto

4. HTSeq-count の使い方

インストール

bash
# pip でインストール
pip install HTSeq

# conda でも可
conda install -c bioconda htseq

# バージョン確認
htseq-count --version

基本コマンド

bash
htseq-count \
  -f bam \
  -r pos \
  -s no \
  -t exon \
  -i gene_id \
  output/sample_Aligned.sortedByCoord.out.bam \
  annotation.gtf \
  > counts.txt

オプション	意味
`-f bam`	入力形式。BAM を使うので `bam` を指定します
`-r pos`	BAM のソート方法。STAR の出力は座標ソート済みなので `pos` です
`-s no`	ストランド特異性。ライブラリに合わせて `no` / `yes` / `reverse` を選びます
`-t exon`	GTF のどの feature を対象にするか。通常はエクソン
`-i gene_id`	集計の単位。`gene_id` で遺伝子単位に集計されます
`annotation.gtf`	アノテーション。マッピング時と同じものを使います
`> counts.txt`	結果をファイルに保存します（リダイレクト）

⚠️ ストランド特異性（-s）は必ず確認する
指定する値はライブラリ調製キットによって変わります。誤るとカウントが大幅に減ります。不明な場合は RSeQC の infer_experiment.py で判定できます。一般的な TruSeq Stranded キットでは reverse を指定します。

出力の形式

text
# 遺伝子ID              カウント数
ENSG00000000003    1523
ENSG00000000005       4
ENSG00000000419     892
...
__no_feature       4821   # どの遺伝子にも対応しなかった
__ambiguous        1204   # 複数遺伝子に重なった
__too_low_aQual     302   # マッピング品質が低すぎた

⚠️ 末尾の特殊行は解析前に除く
アンダースコアで始まる行（__no_feature など）は、どの遺伝子にも割り当てられなかったリードの統計です。発現変動解析の入力にする前に、これらの行を除外します（除外のコードは⑥発現変動解析編に示します）。

慣れてきたら次のオプションも使えます。

-m union：複数の遺伝子に重なるリードの扱い（既定 union）。intersection-strict なども選べます。
-a 10：マッピング品質スコアのしきい値（既定 10）。
--additional-attr gene_name：出力に遺伝子名の列を追加します。
-n 4：使用する CPU コア数（HTSeq 2.0 以降）。

5. 注意点

GTF はマッピング時と同じものを使う：版が違うと遺伝子 ID が対応せず、カウントが欠落します。
-s の誤設定はカウントを大きく減らす：カウント総数が極端に少ないときは、まずここを疑います。
特殊行を残したまま解析しない：__ で始まる行は必ず除外します。

カウント表をこの先どう扱うか

HTSeq-count が返すのは、遺伝子 ID とカウント値が並んだテキストです。ここから先に続くのは、末尾の特殊行を落とし、サンプルごとのファイルを1枚の表にまとめ、遺伝子 ID に名前を対応させる、といった表の操作です。この工程はコマンドのオプションを覚える話ではなく、pandas の DataFrame を書く作業になります。ツールは動かせるのに解析が進まない、という状態はここで起きがちです。

『改訂独習Pythonバイオ情報解析』には、この工程を正面から扱う「RNA-Seq カウントデータの処理」の章があります。pandas の基本を押さえたうえで、カウント表の読み込み、アノテーションの付与、正規化、クラスタリングまでを順に進める構成です。__ で始まる行を除く、複数サンプルを結合する、といった操作を自分で書けるようになります。

改訂独習Pythonバイオ情報解析（実験医学別冊）

羊土社・2025年1月／7,150円（税込）。Miniconda での環境構築、Jupyter Notebook、Python の基本文法、NumPy・pandas による表データの操作を順に押さえたうえで、RNA-Seq カウントデータの処理と Scanpy によるシングルセル解析へ進む構成。

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まとめ

カウントは遺伝子ごとのリード数を集計し、カウントマトリクスを作る工程。
BAM ベース（featureCounts・HTSeq-count）とアラインメントフリー（Salmon・kallisto）の2方式がある。
初学者にはコマンドがシンプルな HTSeq-count。大量サンプルなら featureCounts。
-s（ストランド特異性）はキットに合わせて必ず確認し、__ 行は解析前に除外する。

参考文献

Putri, G. H., Anders, S., Pyl, P. T., Pimanda, J. E., & Zanini, F. (2022). Analysing high-throughput sequencing data in Python with HTSeq 2.0. Bioinformatics, 38(10), 2943–2945. doi:10.1093/bioinformatics/btac166
Anders, S., Pyl, P. T., & Huber, W. (2015). HTSeq—a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics, 31(2), 166–169. doi:10.1093/bioinformatics/btu638
Liao, Y., Smyth, G. K., & Shi, W. (2014). featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics, 30(7), 923–930. doi:10.1093/bioinformatics/btt656
Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., & Kingsford, C. (2017). Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods, 14(4), 417–419. doi:10.1038/nmeth.4197
Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., & Pachter, L. (2016). Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification. Nature Biotechnology, 34(5), 525–527. doi:10.1038/nbt.3519