この記事のゴール
Perturb-seq 解析の中心課題であるガイド効率の問題を理解し、pertpy／Mixscape で「本当に効いた細胞」を見分け、摂動の効果を評価できること。
いつ使うか（文脈特化）
これは Perturb-seq（CRISPR スクリーン ＋ scRNA-seq）のための解析です。各細胞にどの遺伝子を摂動したか（sgRNA）が記録されており、摂動の効果を1細胞解像度で読み取れます。専用の実験設計が前提で、通常の scRNA-seq には当てはまりません。
中心課題 ― ガイド効率
最大の落とし穴はガイド効率です。CRISPR のガイド RNA はおよそ 70〜80% しか効きません。つまり、ある sgRNA を持つ細胞の中にも、実際には摂動が効かなかった細胞（非摂動, NP）が混ざります。これを分けずに解析すると、摂動の効果が薄まって見えます。
pertpy の主な道具
pertpy は摂動解析の統合フレームワークで、主に次を提供します。
- Mixscape：摂動シグネチャ（対照の近傍平均を引いて交絡を除いた発現）を計算し、SP（効いた）と NP（効かない）を分類。NP を除く。
- Augur：どの細胞型が摂動に強く応答したかを、分類器の精度（AUC）でランキング。
- 距離・E-test：摂動どうしの距離（E-distance）と順列検定で、摂動の効果の大きさ・差を評価。
- 応答予測（scGen / CPA など）：未観測の条件での応答を予測する深層生成モデル。
コード（Mixscape）
pythonimport pertpy as pt
import scanpy as sc
# 前提：obs に perturbation（標的遺伝子 or 対照 NT）と replicate がある
ms = pt.tl.Mixscape()
# 1) 摂動シグネチャ：各細胞から対照(NT)の近傍平均を引き、交絡を除く
ms.perturbation_signature(adata, pert_key="perturbation", control="NT", split_by="replicate")
# 2) SP/NP 分類：効いた細胞と効かなかった細胞を見分ける
ms.mixscape(adata, control="NT", labels="perturbation", layer="X_pert")
# 3) 可視化（LDA）
ms.lda(adata, control="NT", labels="perturbation", layer="X_pert")
ms.plot_lda(adata, control="NT")
🔧 環境メモ：pip install pertpy。perturbation_signature が交絡（細胞周期・バッチなど）を除く前処理で、これにより摂動特異的な構造が見えやすくなります。control には非標的対照（NT）を指定します。API はバージョンで変わるため公式チュートリアル参照。
コード（Augur：細胞型の応答度）
pythonimport pertpy as pt
# どの細胞型が摂動に強く応答したかをランキング
ag = pt.tl.Augur(estimator="random_forest_classifier")
adata_au = ag.load(adata, label_col="perturbation", cell_type_col="cell_type")
adata_au, results = ag.predict(adata_au)
results["summary_metrics"] # 細胞型ごとの応答度（AUC が高いほど強く応答）
💡 応答は細胞型で違う
同じ摂動でも、応答の強さは細胞型ごとに異なります。Augur は「どの細胞型が最も動いたか」を優先順位づけし、注目すべき細胞型を絞り込めます。
ツール早見表（pertpy の機能）
| 機能 | 手法 | 何をするか |
|---|---|---|
| 摂動の成否判定 | Mixscape | SP/NP を分け、効かなかった細胞を除く（本記事の中心） |
| 細胞型の応答度 | Augur | どの細胞型が強く応答したかをランキング |
| 摂動間の距離 | E-distance / E-test | 摂動の効果量・差を定量・検定 |
| 応答予測 | scGen / CPA | 未観測条件での応答を予測 |
| 組成変化 | scCODA / Milo | 摂動による細胞組成の変化（→「細胞組成の差」） |
落とし穴
⚠️ つまずきやすい点
– ガイド効率：sgRNA を持つ＝効いた、ではない。Mixscape で NP を除く。
– 対照（NT）が必須：非標的対照がないと摂動シグネチャを作れない。
– 交絡：細胞周期・バッチ・複製効果が摂動と混ざる。摂動シグネチャで除く。
– sgRNA 割り当ての質：マルチプレットや低 MOI で割り当てが不正確だと全体が崩れる。
– 弱い摂動：効果が小さい摂動は SP/NP 分離が難しい。慎重に解釈。
– 応答予測は予測：scGen/CPA の出力は仮説であり、実験で検証する。
まとめ
- Perturb-seq は CRISPR スクリーン ＋ scRNA-seq。最大の課題はガイド効率（70-80%）で、sgRNA を持つ細胞にも非摂動(NP)が混ざる。
- pertpy／Mixscape は、摂動シグネチャで交絡を除き、SP/NP を分類して NP を除く。これで摂動効果を正しく評価できる。
- Augur（細胞型の応答度）、距離/E-test（効果量）、応答予測（scGen/CPA）など pertpy が一通り揃える。
- 対照(NT)必須・交絡除去・sgRNA 割り当ての質・予測は仮説に注意。
下流解析編をひととおり終えて
これで下流解析編の主要トピック――DE → 機能エンリッチメント → 細胞組成の差 → 軌道/velocity → 細胞間相互作用 → GRN/TF活性 → 遺伝子プログラム → CNV → 摂動解析――が揃いました。全体像は「下流解析の全体像」記事から辿れます。各解析に共通するのは、前段（QC・統合・アノテーション）の品質が結論を左右すること、そして推定結果は既知の生物学・実験で検証することです。
関連記事
- 📖 下流解析の全体像：下流解析全体の地図
- 📖 細胞組成の差：摂動による組成変化（scCODA/Milo）
- 📖 CNV 推定（文脈特化）：本記事の前段（がんでのコピー数異常）
参考文献
- Dixit, A., Parnas, O., Li, B., et al. (2016). Perturb-Seq: dissecting molecular circuits with scalable single-cell RNA profiling of pooled genetic screens. Cell, 167, 1853–1866. doi:10.1016/j.cell.2016.11.038
- Papalexi, E., Mimitou, E. P., Butler, A. W., et al. (2021). Characterizing the molecular regulation of inhibitory immune checkpoints with multimodal single-cell screens. Nature Genetics, 53, 322–331. doi:10.1038/s41588-021-00778-2
- Skinnider, M. A., Squair, J. W., Kathe, C., et al. (2021). Cell type prioritization in single-cell data. Nature Biotechnology, 39, 30–34. doi:10.1038/s41587-020-0605-1
- Heumos, L., Ji, Y., May, L., et al. (2025). Pertpy: an end-to-end framework for perturbation analysis. Nature Methods. doi:10.1038/s41592-025-02909-7
- Replogle, J. M., Saunders, R. A., Pogson, A. N., et al. (2022). Mapping information-rich genotype–phenotype landscapes with genome-scale Perturb-seq. Cell, 185, 2559–2575. doi:10.1016/j.cell.2022.05.013
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