イメージング型 空間トランスクリプトーム：ニッチ・近傍解析 ─ 「隣り合っている」は観測ではなく定義

空間トランスクリプトーム解析（spatial transcriptomics）のうちイメージング型（Xenium・CosMx・MERSCOPE など顕微鏡で1分子ずつ数える方式）は、1つ1つの細胞に座標が付いています。だから「どの細胞型が、どの細胞型の隣にいるか」を直接数えられます。これは scRNA-seqにはできないことです。ただし、この解析には最初に決めなければならないことがあります。そもそも「隣」とは何か、という定義です。

1. 「隣」の定義を、先に決める

近傍グラフの作り方は3つあります。Squidpy（Palla et al., Nature Methods, 2022）は、この3つをすべて扱えます。

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import squidpy as sq
import numpy as np

# 3つの作り方を、それぞれ別のキーに保存して比べる
sq.gr.spatial_neighbors(adata, coord_type="generic",
                        delaunay=True, key_added="delaunay")
sq.gr.spatial_neighbors(adata, coord_type="generic",
                        n_neighs=6, key_added="knn6")
sq.gr.spatial_neighbors(adata, coord_type="generic",
                        radius=30.0, key_added="r30")

# 三角分割では、境界の細胞から長い辺が伸びることがある
#   遠すぎる辺は落としておく
D = adata.obsp["delaunay_distances"]
D.data[D.data > 60.0] = 0
D.eliminate_zeros()

# 各細胞が何個の隣を持ったかを確認する
for key in ["delaunay", "knn6", "r30"]:
    deg = np.asarray(adata.obsp[key + "_connectivities"].sum(axis=1)).ravel()
    print(key, "隣の数 中央値:", float(np.median(deg)),
          "最大:", float(deg.max()))

2. 近傍エンリッチメント ─ 偶然と比べる

グラフができたら、「ある2つの細胞型が、偶然より多く隣り合っているか」を検定します。

やり方は単純です。細胞の位置は動かさず、細胞型のラベルだけを入れ替える。これを何百回も繰り返して、観測された隣接の数が偶然の分布からどれだけ離れているかを z スコアにします。

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# 近傍エンリッチメント：ラベルを入れ替えて、偶然との差を見る
sq.gr.nhood_enrichment(adata, cluster_key="celltype",
                       connectivity_key="delaunay", n_perms=1000, seed=0)
sq.pl.nhood_enrichment(adata, cluster_key="celltype", method="ward")

# z スコアの表を取り出して、上位だけを見る
import pandas as pd
z = adata.uns["celltype_nhood_enrichment"]["zscore"]
cts = adata.obs["celltype"].cat.categories
zdf = pd.DataFrame(z, index=cts, columns=cts)

pairs = [
    (a, b, float(zdf.loc[a, b]))
    for i, a in enumerate(cts) for b in cts[i:]
]
pairs.sort(key=lambda t: -t[2])
for a, b, zz in pairs[:10]:
    print("%-18s %-18s z=%.1f" % (a, b, zz))

3. 検定でない指標も併せて見る

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# 相互作用行列：検定ではなく、辺の数の要約
sq.gr.interaction_matrix(adata, cluster_key="celltype",
                         connectivity_key="delaunay", normalized=True)
sq.pl.interaction_matrix(adata, cluster_key="celltype")

# 共起確率：距離を変えながら、一緒にいる確率を見る
sq.gr.co_occurrence(adata, cluster_key="celltype")
sq.pl.co_occurrence(adata, cluster_key="celltype",
                    clusters="腫瘍細胞")

# Ripley の統計量：その細胞型が集まっているか、散らばっているか
sq.gr.ripley(adata, cluster_key="celltype", mode="L")
sq.pl.ripley(adata, cluster_key="celltype", mode="L")

共起確率は、距離のスケールを変えながら見られるのが利点です。「近距離では一緒にいるが、遠くでは関係がない」というパターンが見えます。Ripley の統計量は、細胞型ごとに「集まっているのか、ばらけているのか」を距離の関数として示します。

4. 細胞ニッチ ─ まわりの組成でクラスタリングする

2つの細胞型の関係を見るのではなく、各細胞のまわりに何がいるかを1つのベクトルにして、それをクラスタリングする方法があります。こうして得られるまとまりを細胞ニッチと呼びます。

この考え方は、大腸がんの浸潤先進部を多重免疫染色で解析した研究（Schürch et al., Cell, 2020）で確立されました。同研究は、35 人の患者の 140 の組織領域を 56 のタンパク質マーカーで解析し、9 つの保存されたニッチを同定しています。そして、ニッチの断片化やニッチ間の連絡の途絶が、予後の悪さと結びついていることを示しました。

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import scanpy as sc
import pandas as pd

# 各細胞の「まわりの組成」をベクトルにする
W = adata.obsp["delaunay_connectivities"]
onehot = pd.get_dummies(adata.obs["celltype"]).to_numpy(dtype=float)
comp = W @ onehot # 隣の細胞型を数える
comp = comp / np.maximum(comp.sum(axis=1, keepdims=True), 1)

# 組成ベクトルをクラスタリングすると、ニッチが出てくる
nb = sc.AnnData(comp)
nb.obs_names = adata.obs_names
sc.pp.neighbors(nb, use_rep="X", n_neighbors=15)
sc.tl.leiden(nb, resolution=0.5, key_added="niche", flavor="igraph")
adata.obs["niche"] = nb.obs["niche"].values

# ニッチを組織の上に描く。ここで組織構造と対応するかを確かめる
sq.pl.spatial_scatter(adata, color="niche", shape=None)

# 各ニッチが、どの細胞型でできているかを表にする
prof = pd.DataFrame(comp, columns=adata.obs["celltype"].cat.categories)
prof["niche"] = adata.obs["niche"].values
print(prof.groupby("niche").mean().round(2))

5. 切り方の誤りが、隣接の統計を歪める

ここが、この方式に固有の、最も注意すべき点です。

最も強い検証は、切り方を変えて、同じ解析を回すことです。結論が保たれるなら、それは切り方に依存していません。

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# 切り方を変えて、同じ解析を回す
#   結論が保たれるかどうかが、最も強い検証になる
res = {}
for name, ad in [("装置の既定", ad_vendor),
                  ("分子ベース", ad_baysor)]:
    sq.gr.spatial_neighbors(ad, coord_type="generic", delaunay=True)
    sq.gr.nhood_enrichment(ad, cluster_key="celltype", n_perms=1000, seed=0)
    res[name] = ad.uns["celltype_nhood_enrichment"]["zscore"]

# 2つの z スコア行列の相関を見る
a = res["装置の既定"].ravel()
b = res["分子ベース"].ravel()
print("z スコアの相関:", round(float(np.corrcoef(a, b)[0, 1]), 3))
# 低ければ、結論は切り方に依存している

# とくに、同じ型どうしの隣接を確認する
diag = np.diag(res["装置の既定"])
print("同型どうしの z スコア:", np.round(diag, 1))

6. 組織の形が、結果を歪める

• 境界効果：組織の端にある細胞は、片側にしか隣がいません。端に多い細胞型は、隣の数が系統的に少なくなります。
• 組織の外の空白：三角分割では、空白をまたいで長い辺が張られます。距離の上限を決めて落としてください。
• 組織片が分かれている場合：離れた組織片どうしが辺でつながることがあります。組織ごとにグラフを作るのが正しい。

7. 複数サンプルを比べる

サンプル間でニッチや隣接パターンを比べるとき、比べられる形にそろえる必要があります。

• 近傍グラフの作り方とパラメータを、全サンプルで統一する。
• セグメンテーションも統一する。切り方が違えば、隣接の統計も違ってくる。
• 細胞型のラベル体系をそろえる。サンプルごとに独立でアノテーションすると、同じ名前が同じものを指さない。
• ニッチは、全サンプルをまとめてクラスタリングする。別々にやると、ニッチ1どうしが対応しない。

8. チェックリスト

• 近傍グラフの作り方とパラメータを決め、記録したか
• 三角分割なら、長すぎる辺を落としたか
• 各細胞の隣の数の分布を確認したか
• z スコアと実際の辺の本数を並べて見たか
• z スコアの上位だけを解釈しているか（p 値で足切りしていないか）
• ニッチを組織の上に描いて、構造と対応するか確認したか
• 同じ型どうしの隣接を、純度の指標と併せて確認したか
• 切り方を変えて、結論が保たれるかを確かめたか
• 組織の端や空白の影響を考慮したか
• 複数サンプルなら、グラフ・切り方・ラベル体系をそろえたか

まとめ

• 「隣り合っている」は観測ではなく、こちらが定義したもの。半径・k 近傍・三角分割で結論が変わる。迷ったら三角分割。
• 近傍エンリッチメントは位置を固定してラベルだけ入れ替えるので、細胞密度の偏りは自動的に相殺される。
• しかし帰無仮説は「組織全体でランダム」であり、組織には構造があるのでほぼ必ず破れている。p 値ではなくz スコアの順位で解釈する。
• z スコアと実際の辺の本数を並べて見る。稀な型どうしでは、有意でも数本しかないことがある。
• ニッチは細胞型より上の単位。まわりの組成をベクトルにしてクラスタリングする（Schürch et al., 2020）。細胞型とニッチの両方を持つ。
• 切り方の誤りが、隣接の統計をそのまま歪める。過分割は同じ型どうしの隣接を水増しし、過統合はペアを消す。
• 結果を見ただけでは生物学と区別できないので、切り方を変えて結論が保たれるかを確かめる。これは論文に書ける検証になる。
• 組織の端・空白・分かれた組織片が、グラフを歪める。距離の上限を決める。

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参考文献

• Palla, G., Spitzer, H., Klein, M., et al. (2022). Squidpy: a scalable framework for spatial omics analysis. Nature Methods, 19(2), 171–178. doi:10.1038/s41592-021-01358-2
• Schürch, C. M., Bhate, S. S., Barlow, G. L., et al. (2020). Coordinated cellular neighborhoods orchestrate antitumoral immunity at the colorectal cancer invasive front. Cell, 182(5), 1341–1359.e19. doi:10.1016/j.cell.2020.07.005
• Petukhov, V., Xu, R. J., Soldatov, R. A., et al. (2022). Cell segmentation in imaging-based spatial transcriptomics. Nature Biotechnology, 40(3), 345–354. doi:10.1038/s41587-021-01044-w
• Heidari, E., Moorman, A., Unyi, D., et al. (2025). Segger: fast and accurate cell segmentation of imaging-based spatial transcriptomics data. bioRxiv（プレプリント）. doi:10.1101/2025.03.14.643160
• Janesick, A., Shelansky, R., Gottscho, A. D., et al. (2023). High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nature Communications, 14(1), 8353. doi:10.1038/s41467-023-43458-x
• Cervilla, S., Grases, D., Perez, E., et al. (2026). A technical comparison of spatial transcriptomics platforms across six cancer types. Genome Biology, 27, 22. doi:10.1186/s13059-026-03937-y
• Marconato, L., Palla, G., Yamauchi, K. A., et al. (2025). SpatialData: an open and universal data framework for spatial omics. Nature Methods, 22(1), 58–62. doi:10.1038/s41592-024-02212-x
• Wolf, F. A., Angerer, P., & Theis, F. J. (2018). SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biology, 19, 15. doi:10.1186/s13059-017-1382-0
• Traag, V. A., Waltman, L., & van Eck, N. J. (2019). From Louvain to Leiden: guaranteeing well-connected communities. Scientific Reports, 9, 5233. doi:10.1038/s41598-019-41695-z