シーケンス型 空間トランスクリプトーム：cell2location 実践 ─ 割合ではなく、細胞数を推定する

空間トランスクリプトーム解析（spatial transcriptomics）のうちシーケンス型（Visium・Stereo-seq など NGS で読み出す方式）は、デコンボリューションが要ります。その中で cell2location（Kleshchevnikov et al., Nature Biotechnology, 2022）は、割合ではなく細胞数そのものを推定するという、他にない性質を持っています。階層ベイズモデルなので計算コストは高いのですが、16 手法のベンチマーク（Li et al., Nature Methods, 2022）でも Spotless（Sang-aram et al., eLife, 2023）でも総合上位に来ており、最初に試す価値があります。

1. cell2location が持っている3つの性質

• 絶対量を返す：細胞型ごとの「細胞数」を推定する。割合ではないので、細胞密度の違いが残る。
• 稀な細胞型を拾える：フィーチャ間で統計的な情報を借り合う設計なので、1つのフィーチャだけでは弱いシグナルも拾える。
• 技術差をモデル化する：参照と空間データで遺伝子の捕まりやすさが違うことを、モデルの中で吸収する。

代償は計算コストです。GPU がほぼ必須で、GPU を使っても RCTD などより時間がかかります。その代わり、ベイズモデルなので推定の不確かさが分布として返ります。

2. 2段階のワークフロー

段階1は参照 scRNA-seq だけを使います。負の二項回帰をあてて、細胞型ごとの発現シグネチャを推定します。このとき batch_key にドナーや実験日を指定すると、ドナー間の差を吸収した、きれいなシグネチャが得られます。

段階2で、そのシグネチャを空間データに当てます。ここで初めて空間データが登場します。

3. 環境構築

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# GPU があることを前提にする。CPU でも動くが、実用的な速度にはならない
conda create -y -n c2l python=3.10
conda activate c2l
pip install cell2location

# GPU が見えているかを確認する
python -c "import torch; print(torch.cuda.is_available())"

4. 段階1 ─ 参照からシグネチャを作る

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import scanpy as sc
from cell2location.models import RegressionModel
from cell2location.utils.filtering import filter_genes

# 参照 scRNA-seq。生のカウントを渡す
adata_ref.X = adata_ref.layers["counts"].copy()

# 情報量の少ない遺伝子を落とす
selected = filter_genes(
    adata_ref,
    cell_count_cutoff=5,
    cell_percentage_cutoff2=0.03,
    nonz_mean_cutoff=1.12,
)
adata_ref = adata_ref[:, selected].copy()

# batch_key にドナーや実験日を入れると、その差を吸収したシグネチャができる
RegressionModel.setup_anndata(
    adata=adata_ref,
    batch_key="donor",
    labels_key="cell_type",
)

mod = RegressionModel(adata_ref)
mod.train(max_epochs=250, batch_size=2500, train_size=1, lr=0.002)

# 事後分布を要約して、シグネチャを取り出す
adata_ref = mod.export_posterior(
    adata_ref, sample_kwargs={"num_samples": 1000, "batch_size": 2500}
)
inf_aver = adata_ref.varm["means_per_cluster_mu_fg"]
inf_aver.columns = adata_ref.uns["mod"]["factor_names"]
print(inf_aver.shape)   # (遺伝子, 細胞型)

5. 2つのハイパーパラメータ ─ ここが実質のすべて

cell2location で自分が決めるのは、たった2つです。そしてこの2つを間違えると、結果は意味を失います。

6. N_cells_per_location ─ 組織像から数える

「1つのフィーチャに、平均で何個の細胞がいるか」を指定します。この値が、推定される細胞数の全体のスケールを決めます。大きすぎれば水増しになり、小さすぎれば細胞を取りこぼします。

公式ドキュメントは、組織像から推定することを明示的に求めています。チュートリアルの値（30）はリンパ節の値であって、あなたの組織の値ではありません。

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import numpy as np
from stardist.models import StarDist2D

# H&E 画像から核を検出して、1スポットあたりの細胞数を見積もる
model = StarDist2D.from_pretrained("2D_versatile_he")
labels, _ = model.predict_instances(he_norm)
n_nuclei = int(labels.max())

# 組織が載っている面積を µm² に直す
area_um2 = tissue_area_px * (um_per_px ** 2)
density = n_nuclei / area_um2                # 核の数 / µm²

# Visium のスポットは直径 55 µm の円。面積は およそ 2,400 µm²
spot_area = np.pi * (55 / 2) ** 2
print("N_cells_per_location の目安:", round(density * spot_area, 1))

7. detection_alpha ─ QC の診断と同じ判断

スライド内で、RNA の検出感度がどれだけばらつくかを、モデルにどう伝えるかのパラメータです。値が大きいほど強く正則化し、「感度は場所によらずほぼ一定」と仮定します。

公式ドキュメントは、判断基準をこう述べています。総 RNA カウントの、バッチ内での変動が、組織像で見て「そこに細胞が多いから」では説明できないなら、detection_alpha=20 を使う。

8. 段階2 ─ 空間データに当てる

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from cell2location.models import Cell2location

# 共通遺伝子だけに絞る
common = [g for g in inf_aver.index if g in adata_vis.var_names]
print("共通遺伝子:", len(common))
adata_vis = adata_vis[:, common].copy()
inf_aver = inf_aver.loc[common, :]

# ここでも生のカウントを渡す
adata_vis.X = adata_vis.layers["counts"].copy()
Cell2location.setup_anndata(adata=adata_vis, batch_key="sample")

mod = Cell2location(
    adata_vis,
    cell_state_df=inf_aver,
    N_cells_per_location=8,   # 組織像から数えた値に置き換える
    detection_alpha=20,       # 20 と 200 の両方を試す
)
mod.train(max_epochs=30000, batch_size=None, train_size=1)

adata_vis = mod.export_posterior(
    adata_vis,
    sample_kwargs={"num_samples": 1000, "batch_size": mod.adata.n_obs},
)

9. 結果を読む ─ なぜ q05 なのか

cell2location はベイズモデルなので、返ってくるのは1つの数字ではなく事後分布です。obsm には、平均・標準偏差・5% 分位点（q05）・95% 分位点（q95）が入ります。

実務では q05 を使うのが標準です。「少なくともこれだけの細胞はいる」という、保守的な推定だからです。

平均を使うと、推定に自信がない場所でも高い値が出ます。事後分布が広いということは「よく分からない」ということなのに、平均を取ると、それなりの値が返ってしまう。その結果、稀な細胞型を過剰に検出しがちになります。

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import squidpy as sq

# q05 = 5% 分位点。「少なくともこれだけはいる」という保守的な推定
abund = adata_vis.obsm["q05_cell_abundance_w_sf"]
abund.columns = adata_vis.uns["mod"]["factor_names"]
print(abund.iloc[:3].round(2))

# 細胞型ごとに、組織の上に描く
for ct in abund.columns[:4]:
    adata_vis.obs[ct] = abund[ct].values
sq.pl.spatial_scatter(adata_vis, color=list(abund.columns[:4]), ncols=2)

# 推定された総細胞数。これが検証の要になる
adata_vis.obs["n_cells_est"] = abund.sum(axis=1).values
sq.pl.spatial_scatter(adata_vis, color="n_cells_est")

10. モデルの QC ─ 結果を信じてよいか

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# 学習曲線。下がりきっていなければ、max_epochs を増やす
mod.plot_history(1000)

# モデルの QC。総 RNA カウント と 推定した総細胞数 の関係を見る
mod.plot_QC()
# 直線的に並ぶのが望ましい。大きく外れる点があれば、
# その場所は技術的な問題を抱えているか、参照が合っていない

# 推定した総細胞数と、組織像の核数を突き合わせる
# ここがずれるなら、N_cells_per_location が合っていない

• 学習曲線：ELBO が下がりきっていなければ、max_epochs を増やす。
• plot_QC()：総 RNA カウントと、推定された総細胞数の関係を見る。直線的に並ぶのが望ましい。大きく外れる点は、技術的な問題か、参照が合っていない場所。
• 推定された総細胞数 vs 組織像の核数：これが最も重要な検証。系統的にずれるなら、N_cells_per_location が合っていない。

11. 発展 ─ 細胞型の共局在を見つける

cell2location には、推定した細胞数の行列を NMF で分解して、どの細胞型が一緒に出てくるかを見つける機能があります。

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from cell2location import run_colocation

# 細胞型が一緒に出てくるパターン（微小環境）を NMF で見つける
res, adata_vis = run_colocation(
    adata_vis,
    model_name="CoLocatedGroupsSklearnNMF",
    train_args={
        "n_fact": [8],           # 微小環境の数
        "sample_name_col": "sample",
        "n_restarts": 3,
    },
)
# 「腫瘍細胞 + 疲弊 T細胞 + マクロファージ」のような組み合わせが見つかる
# これがニッチ解析の入口になる

「腫瘍細胞 ＋ 疲弊 T細胞 ＋ マクロファージ」のような組み合わせが、1つの因子として出てきます。これは組織の中の微小環境（ニッチ）にほかなりません。ニッチ解析への、そのままの入口になります。

12. つまずきやすい点

まとめ

• cell2location は2段階。参照からシグネチャを作り、それを空間に当てる。どちらの段階でも生のカウントを渡す。
• 自分で決めるのは2つのハイパーパラメータだけ。そしてこの2つがすべてを決める。
• N_cells_per_location は組織像から数える。チュートリアルの 30 はリンパ節の値であって、あなたの組織の値ではない。
• detection_alpha は、QC でやった診断そのもの。総カウントの変動が細胞密度で説明できるなら 200、できないなら 20。両方試す。
• 返るのは事後分布。q05（保守的な推定）を使う。平均を使うと、稀な細胞型を過剰に検出する。
• 検証の要は、推定した総細胞数が、組織像の核数と合っているか。
• NMF による共局在解析が、そのままニッチ解析の入口になる。

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参考文献

• Kleshchevnikov, V., Shmatko, A., Dann, E., et al. (2022). Cell2location maps fine-grained cell types in spatial transcriptomics. Nature Biotechnology, 40(5), 661–671. doi:10.1038/s41587-021-01139-4
• Cable, D. M., Murray, E., Zou, L. S., et al. (2022). Robust decomposition of cell type mixtures in spatial transcriptomics. Nature Biotechnology, 40(4), 517–526. doi:10.1038/s41587-021-00830-w
• Li, B., Zhang, W., Guo, C., et al. (2022). Benchmarking spatial and single-cell transcriptomics integration methods for transcript distribution prediction and cell type deconvolution. Nature Methods, 19(6), 662–670. doi:10.1038/s41592-022-01480-9
• Sang-aram, C., Browaeys, R., Seurinck, R., & Saeys, Y. (2023). Spotless, a reproducible pipeline for benchmarking cell type deconvolution in spatial transcriptomics. eLife, 12, RP88431. doi:10.7554/eLife.88431
• Bhuva, D. D., Tan, C. W., Salim, A., et al. (2024). Library size confounds biology in spatial transcriptomics data. Genome Biology, 25, 99. doi:10.1186/s13059-024-03241-7
• Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., & Myers, G. (2018). Cell detection with star-convex polygons. In Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention (MICCAI) 2018, 265–273. doi:10.1007/978-3-030-00934-2_30
• Polański, K., Bartolomé-Casado, R., Sarropoulos, I., et al. (2024). Bin2cell reconstructs cells from high resolution Visium HD data. Bioinformatics, 40(9), btae546. doi:10.1093/bioinformatics/btae546
• Wolf, F. A., Angerer, P., & Theis, F. J. (2018). SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biology, 19, 15. doi:10.1186/s13059-017-1382-0
• Palla, G., Spitzer, H., Klein, M., et al. (2022). Squidpy: a scalable framework for spatial omics analysis. Nature Methods, 19(2), 171–178. doi:10.1038/s41592-021-01358-2