シーケンス型 空間トランスクリプトーム 前処理の全体像 ─ 読み込みからクラスタリングまで

空間トランスクリプトーム解析（spatial transcriptomics）のうちシーケンス型（Visium・Stereo-seq など NGS で読み出す方式）は、前処理の段階から scRNA-seq とは別の判断を求められます。指標も関数もほとんど同じものを使うのに、途中で2か所だけ、scRNA-seq の手順をそのまま持ち込むと結果が壊れる場所があります。この記事では、前処理の全体を順番に追いながら、その2か所がどこで、なぜそうなるのかを説明します。

1. 前処理のゴール

前処理のゴールは、下流解析に渡せる「解析単位 × 遺伝子」のカウント行列を1つ作ることです。

scRNA-seq なら、この行列は「細胞 × 遺伝子」で、行が何を指すかは考えるまでもありません。シーケンス型では違います。行が何を指すか（55 µm のスポットか、8 µm のビンか、再構成した細胞か）は、自分で決めるものです。ここが最初の分かれ道になります。

2. 前処理の順番と、その順番でなければならない理由

7つの手順のうち、3（解析単位の決定）と 6（正規化）だけが、scRNA-seq の常識をそのまま当てはめると失敗します。残りはほぼ同じ考え方で通ります。以下、順に見ていきます。

3. 手順1 ─ 読み込みとデータ構造

Space Ranger（Visium 系）や SAW（Stereo-seq）が出力したファイル群を、SpatialData（Marconato et al., Nature Methods, 2025）に読み込みます。SpatialData は、発現行列・組織画像・フィーチャの輪郭を同じ座標系の上にそろえて保持する枠組みです。

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import spatialdata_io as sdio
import squidpy as sq

sdata = sdio.visium_hd("data/visium_hd_run")

# 何がどこに入っているかを確認する
print(list(sdata))   # ['square_002um', 'square_008um', 'square_016um']
print(list(sdata.images))   # CytAssist 画像・顕微鏡画像
print(list(sdata.shapes))   # 各ビンの正方形
print(sdata.coordinate_systems)  # 共通座標系

4. 手順2 ─ 組織検出

捕捉基板は組織より広いので、組織が載っていない場所のフィーチャも出力されます。これを先に外さないと、QC の分布が「ほぼ空のフィーチャ」に引っ張られ、閾値の判断ができなくなります。

組織検出は Space Ranger や SAW が自動で行いますが、組織の縁、切片の折れ込み、気泡、色の薄い領域では誤ることがあります。必ず画像に重ねて目で確認してください。自動判定が組織の一部を落としている場合は、手動でマスクを修正します。

5. 手順3 ─ 解析単位の決定（最初の落とし所）

ここが1つめの「scRNA-seq の手順が通じない場所」です。解析単位は QC より先に決めなければなりません。

bin20 は 10 µm × 10 µm で、哺乳類の細胞とほぼ同じ大きさです。STOmics は、bin20 あたりの遺伝子数の中央値が 200 を超え、かつ核染色画像の品質が良いときに、細胞単位（cellbin）での解析を勧めています。カウントが足りなければ bin50 や bin100 に下げます。細胞単位への再構成は、Visium HD なら bin2cell（Polański et al., Bioinformatics, 2024）が担当します。

6. 手順4 ─ QC は、指標は同じ、解釈が違う

計算する指標は scRNA-seq の QCと同じです。総カウント、検出遺伝子数、ミトコンドリア率。関数もそのまま使えます。違うのは、その数字をどう読むかです。

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import scanpy as sc
import numpy as np

# 解析単位を決めてから QC する（ここでは 8 µm ビン）
adata = sdata["square_008um"].copy()

# 指標の計算は scRNA-seq と同じ
adata.var["mt"] = adata.var_names.str.startswith("MT-")
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, qc_vars=["mt"], inplace=True, log1p=False)

# 違うのはここから。必ず空間の上で見る
sq.pl.spatial_scatter(
    adata,
    color=["total_counts", "n_genes_by_counts", "pct_counts_mt"],
    shape=None, size=1,
)

# 分布を見てから閾値を決める（先に決めない）
print(np.percentile(adata.obs["total_counts"], [1, 5, 25, 50, 75]))

• フィーチャは細胞ではない。「低カウント＝壊れた細胞」という読み替えができない。
• 低カウントの領域が、生物学的に正しいことがある。脂肪組織、壊死巣、線維化した領域、軟骨、白質などは、もともと細胞密度も RNA 量も少ない。
• ミトコンドリア率が高いのが正常な組織がある。心筋、肝、褐色脂肪など。組織を見ずに「20% 以上を除く」と決めると、心筋細胞をまるごと消すことになる。
• 技術由来の空間的な勾配がある。透過処理のムラ、切片の端、スライドの位置による差。これは生物学ではないので、空間プロットで見分ける。

7. 手順5 ─ 捨ててよいもの、捨ててはいけないもの

遺伝子側は迷う必要がありません。どのフィーチャでも検出されない遺伝子は落として構いません。問題はフィーチャ側です。

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# 遺伝子側：どのフィーチャでも 0 の遺伝子は落としてよい
sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=10)

# フィーチャ側：閾値は空間プロットを見てから。組織学的に説明できるかを確認する
keep = adata.obs["total_counts"] >= 100
print("除外されるフィーチャの割合:", 1 - keep.mean())
adata = adata[keep].copy()

フィーチャを落とすときは、必ず「落とした結果、組織のどこが欠けたか」を空間プロットで確認してください。組織の一部が丸ごと消えているなら、それは技術的な不良ではなく生物学的な特徴を消してしまった可能性があります。

8. 手順6 ─ 正規化（2つめの落とし所）

ここが2つめの、そして最も重要な「scRNA-seq の手順が通じない場所」です。

scRNA-seq では、総カウント（ライブラリサイズ）の差は技術的なノイズだと考えます。同じ細胞型でも捕捉効率が違うだけなので、総カウントで割って揃えるのが正しい。シーケンス型では、この前提が成り立ちません。

1つのフィーチャに何個の細胞が入っているかは、組織の場所によって違います。細胞が密に詰まった腫瘍の領域ではカウントが多く、細胞のまばらな間質や白質では少ない。つまり総カウントそのものが、組織構造を反映した生物学的な信号です。これを技術ノイズとみなして割ってしまうと、組織構造の情報ごと消えます。

この問題は実際に測定されています。4つの空間技術・25検体を調べた研究（Bhuva et al., Genome Biology, 2024）では、ライブラリサイズが組織の領域と強く結びついていました。しかも、細胞数で割った「1細胞あたりの検出数」でさえ領域ごとに違い、腫瘍領域では1細胞あたりの検出数が高いという結果でした。細胞密度だけでは説明できない、領域固有の効果があるということです。

そして肝心なのは結果のほうです。同研究では、sctransform でライブラリサイズを明示的に補正すると、空間ドメイン同定の精度（ARI）がむしろ下がりました。グラフベースのクラスタリングでも、空間を考慮する手法でも、同じ傾向でした。著者らは「空間データはライブラリサイズを特別に補正すべきでない」と結論しています。

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# 生のカウントを必ず取っておく。デコンボリューションはこれを使う
adata.layers["counts"] = adata.X.copy()

# 正規化は「クラスタリングと可視化のため」の工程だと割り切る
sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4)
sc.pp.log1p(adata)
adata.layers["lognorm"] = adata.X.copy()

# 空間ドメインを見たいときは、正規化しない側とも比べる
# adata.X = adata.layers['counts'] に戻せるようにしておく

9. 手順7 ─ 特徴選択・次元削減・クラスタリング

ここから先は scRNA-seq の手順とほとんど同じです。高変動遺伝子を選び、PCA で次元を落とし、近傍グラフを作り、Leiden でクラスタリングする。

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# ここから先は scRNA-seq とほぼ同じ。空間情報はまだ使わない
sc.pp.highly_variable_genes(adata, n_top_genes=2000, flavor="seurat")
sc.pp.pca(adata, n_comps=50)
sc.pp.neighbors(adata, n_neighbors=15)
sc.tl.leiden(adata, resolution=1.0, key_added="leiden")

# 発現だけで作ったクラスタを、空間の上に描いて確かめる
sq.pl.spatial_scatter(adata, color="leiden", shape=None)
# 組織構造と対応していれば、前処理は概ね成功している

10. 複数のスライスがある場合

切片が複数ある場合、切片間・スライド間・ロット間の差が出ます。透過処理の条件、RNA の品質、実験日。これらは Harmony や scVI で補正できます。scRNA-seq と同じ道具立てです。

11. 前処理チェックリスト

• 解析単位を決めてから QC したか（2 µm ビンのまま QC していないか）
• 組織検出の結果を画像に重ねて確認したか
• 低カウント領域の位置を空間プロットで見たか
• その低カウントが組織学的に説明できるかを考えたか
• ミトコンドリア率の閾値を、組織の種類を踏まえて決めたか
• 生のカウントを layers[“counts”] に残したか
• デコンボリューションに正規化済みの行列を渡していないか
• 発現だけで作ったクラスタを、組織の上に描いて確認したか

まとめ

• 前処理のゴールは「解析単位 × 遺伝子」の行列を1つ作ること。行が何を指すかは自分で決める。
• 解析単位は QC より先に決める。2 µm ビンのまま QC すると、これから細胞に組み立てるビンを捨ててしまう。
• QC の指標は scRNA-seq と同じでよいが、解釈が違う。低カウント領域は生物学的に正しいことがある。閾値は空間プロットを見てから決める。
• 総カウントには組織の情報が入っている。ライブラリサイズを scRNA-seq 流に補正すると、空間ドメイン同定の精度が下がる（Bhuva et al., 2024）。
• 生のカウントは必ず残す。デコンボリューションはカウントの分布そのものを使う。
• 正規化は必須の儀式ではなく、目的ごとに選ぶ工程。あとから選び直せるようにしておく。
• 次元削減・クラスタリングでは、まだ空間情報を使わない。これがベースラインになる。

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参考文献

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• Salim, A., Bhuva, D. D., Chen, C., et al. (2025). SpaNorm: spatially-aware normalization for spatial transcriptomics data. Genome Biology, 26, 109. doi:10.1186/s13059-025-03565-y
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