空間トランスクリプトーム解析（spatial transcriptomics）のうちシーケンス型（Visium・Stereo-seq など NGS で読み出す方式）は、組織の上に並べた空間バーコードで mRNA を捕まえ、配列を読んでから座標に戻す方式です。プローブのパネルに縛られず、原理的には全転写産物をねらえます。その代わり、測定の単位（フィーチャ）と細胞の単位が一致しないという、この方式に固有の問題を最初から抱えています。この記事では、データを受け取ってから生物学的な結論に至るまでの道筋を、地図として示します。
1. シーケンス型で測れるもの、測れないもの
測れるものは、組織の上のある座標に、どの遺伝子の転写産物が何個あったか、です。配列を読むので、あらかじめ標的を決めておく必要がありません。どの遺伝子が効いているか見当がついていない探索的な段階では、これが決定的な強みになります。
測れないものは、細胞の境界です。捕捉されたRNAは「どのフィーチャに落ちたか」しか分からず、「どの細胞から出たか」の情報は持っていません。細胞という単位は、あとから計算で作り出すしかありません。この一点が、シーケンス型の解析全体を規定します。
同じシーケンス型でも、捕捉の化学が2系統あります。poly-A 捕捉（オリゴdT で mRNA のポリA尾部を直接つかまえる）なら、文字どおり全転写産物が対象で、生物種も選びません。一方、FFPE 対応の世代（Visium CytAssist、Visium HD）はプローブ捕捉で、対象はヒト・マウスのタンパク質コード遺伝子（およそ 18,000 / 20,000）に限られます。lncRNA や新規転写産物は、そもそもプローブがないので見えません。
2. 捕捉の化学が、使える検体と見える遺伝子を決める
プラットフォームを選ぶとき、解像度の前に決まってしまうのがこの軸です。「FFPE ブロックがある」「ヒト・マウス以外の生物種だ」といった条件は、この時点で選べるプラットフォームをかなり絞ります。
| 観点 | poly-A 捕捉 | プローブ捕捉 |
|---|---|---|
| しくみ | オリゴdT がポリA尾部を直接つかまえる | 標的に相補的なプローブ対を結合・連結する |
| 検体 | 新鮮凍結が基本 | FFPE が使える。断片化した RNA に強い |
| 生物種 | 選ばない | ヒト・マウス（プローブセットがある種のみ） |
| 見える遺伝子 | 全転写産物（lncRNA・新規転写産物も） | タンパク質コード遺伝子（およそ 18,000 / 20,000） |
| 代表 | Visium（新鮮凍結）、Stereo-seq、Curio Seeker、Visium HD 3′ | Visium CytAssist、Visium HD |
病理のアーカイブにあるのは FFPE ブロックです。新鮮凍結を前提とした poly-A 捕捉のプラットフォームは、この資産をそのまま使えません。逆に、非モデル生物や植物を扱うならプローブセットが存在しないため、poly-A 捕捉しか選べません。解像度の議論より先に、この制約を確認してください。
3. プラットフォームの一覧
| プラットフォーム | 1フィーチャの大きさ | 捕捉の化学 | 捕捉面積 | 備考 |
|---|---|---|---|---|
| Visium v1 / v2（CytAssist） | 55 µm スポット（100 µm 間隔） | poly-A（新鮮凍結）／プローブ（FFPE） | 6.5 × 6.5 mm | スポットの間に隙間がある |
| Visium HD | 2 µm ビン（連続格子） | プローブ | 6.5 × 6.5 mm | 隙間なし。2 / 8 / 16 µm ビンで出力 |
| Visium HD 3′ | 2 µm ビン | poly-A | 6.5 × 6.5 mm | Space Ranger v4 以降が対応 |
| Curio Seeker（Slide-seq 由来） | 10 µm ビーズ | poly-A | 組織に応じたタイル | 専用機器が要らない。生物種を選ばない |
| Curio Trekker（Slide-tags 由来） | 単一核ごと | poly-A | ─ | 核に空間バーコードを付け、通常の scRNA-seq に乗せる |
| Stereo-seq（STOmics） | 直径 220 nm・500 nm 間隔 | poly-A | 0.5 × 0.5 cm 〜 2 × 3 cm | 捕捉面積が桁違いに大きい |
| GeoMx DSP | 任意の形の ROI | プローブ | スライド全面 | 領域選択型。単一細胞解像度ではない |
Stereo-seq は 2 × 3 cm という切片まるごとのスケールを、サブセル解像度のまま扱えます。マウス胚のような大きな組織を一枚で見たい場合、この面積が効いてきます（Chen et al., Cell, 2022）。
4. 解析の全体像
シーケンス型の解析は、大きく6つの段階に分かれます。このうち、正規化から先は scRNA-seq の手順とほとんど同じです。逆に言えば、シーケンス型に固有の判断は前半に集中しています。
最も重要なのは 3 番目の「解析単位の決定」です。ここで何を1つの観測単位とするかを決めないと、そのあとのクラスタリングも細胞型の割り当ても、何を数えているのか分からないものになります。
5. 最初の分岐点 ─ 解析単位（analysis unit）をどう決めるか
判断の材料は1つです。フィーチャの大きさと、細胞の大きさを比べる。哺乳類の細胞はおおよそ 10〜30 µm ですから、フィーチャがそれより大きいか小さいかで、解くべき問題が反対を向きます。
プラットフォームごとに、選べる解析単位は決まっています。
| プラットフォーム | 選べる解析単位 | 実務上の出発点 |
|---|---|---|
| Visium v1 / v2 | 55 µm スポットのみ | スポットのまま。デコンボリューションへ |
| Visium HD | 2 / 8 / 16 µm ビン、または細胞 | 8 µm ビン。必要なら細胞へ再構成 |
| Curio Seeker | 10 µm ビーズのみ | ビーズのまま。doublet モードのデコンボリューションへ |
| Stereo-seq | bin1〜bin200、または cellbin | bin50 で全体像。条件を満たせば cellbin へ |
bin20 は 10 µm × 10 µm で、哺乳類の細胞とほぼ同じ大きさです。bin50・bin100 も実際によく使われ、bin200 は出力を素早く眺めるための単位です。STOmics は、bin20 あたりの遺伝子数の中央値が 200 を超え、かつ核染色画像の品質が良いときに細胞単位（cellbin）での解析を勧めています。カウントが足りなければ bin50 や bin100 に下げます。解像度は「上げられるだけ上げる」ものではなく、カウントが許す範囲で上げるものです。
格子状のビンは、細胞の境界を無視して機械的に切ります。マウス脳の Stereo-seq データでは、bin20 で切ると約 90% の細胞が複数のビンに分断されたのに対し、核染色画像からセグメンテーションした cellbin では分断が約 2% にとどまりました。「ビンの大きさが細胞と同じくらいだから細胞として扱ってよい」とはなりません。
6. QC が scRNA-seq と違うところ
QC の指標そのもの（総カウント、検出遺伝子数、ミトコンドリア率）は scRNA-seq の QCと同じものを使えます。違うのはその解釈です。
- フィーチャは細胞ではないので、「低カウント＝壊れた細胞」という読み替えができない。
- 低カウントの領域は、生物学的に正しいことがある。脂肪組織、壊死巣、線維化した領域、軟骨などは、もともと RNA が少ない。ここを機械的に切り捨てると、注目すべき領域を最初に消してしまう。
- 組織の外のフィーチャを除く工程（組織検出）が必要。Space Ranger や SAW が自動で行うが、組織の縁や折れ込みでは誤ることがあるので、画像と重ねて確認する。
- カウントの空間的な偏りを見る。透過処理のムラや切片の端で系統的に低くなることがあり、これは生物学ではなく技術由来。
python
import scanpy as sc
import numpy as np
# QC 指標を計算する（ここまでは scRNA-seq と同じ）
adata.var["mt"] = adata.var_names.str.startswith("MT-")
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, qc_vars=["mt"], inplace=True)
# 空間的に見る。低カウントの領域が「組織学的に妥当か」を必ず確認する
sq.pl.spatial_scatter(adata, color=["total_counts", "n_genes_by_counts"])
# 機械的に切り捨てず、まず分布を見てから閾値を決める
counts = adata.obs["total_counts"].values
print(np.percentile(counts, [1, 5, 25, 50, 75]))
scRNA-seq の感覚で「総カウント 500 未満を除く」と機械的に設定すると、組織のどの領域を捨てたのかが分からなくなります。空間プロットで低カウント領域の位置を必ず確認し、それが組織学的に説明できるかを見てから閾値を決めてください。
7. 細胞型をどう割り当てるか ─ 3つのルート
解析単位が決まると、細胞型の割り当て方も自動的に決まります。
| レジーム | 手法 | 代表ツール | 必要なもの |
|---|---|---|---|
| マルチセル（フィーチャ ＞ 細胞） | デコンボリューション | cell2location、RCTD（multi）、CARD、Tangram | 参照 scRNA-seq |
| 準単一細胞（同程度） | ダブレット分離 | RCTD（doublet モード） | 参照 scRNA-seq |
| サブセル（フィーチャ ＜ 細胞） | 集約・セグメンテーション | bin2cell、SAW CellBin | 核染色画像と十分なカウント |
| サブセル（画像やカウントが足りない） | segmentation-free | FICTURE | なし（教師なしでも動く） |
16 の統合手法を 45 の実データと 32 のシミュレーションで比較したベンチマーク（Li et al., Nature Methods, 2022）では、スポットの細胞型デコンボリューションでは cell2location・SpatialDWLS・RCTD が上位に、測っていない遺伝子の空間分布を予測する課題では Tangram・gimVI・SpaGE が上位に来ました。用途が違えば勝つ手法も違うということです。
いずれのルートでも、最終的に細胞型を決める段階では参照となる scRNA-seq が要ります。つまりシーケンス型の空間解析は、事実上 scRNA-seq の細胞型アノテーションの上に乗っています。参照データの質が悪ければ、空間側の結果もそれ以上にはなりません。唯一の例外が FICTURE（Si et al., Nature Methods, 2024）のような segmentation-free な因子分解で、これは教師なしでも組織構造を復元できます。
8. 名目の解像度を、そのまま信じない
フィーチャを小さくしても、実際に区別できる距離が同じだけ小さくなるとは限りません。組織を透過処理して RNA を基板へ移す過程で、分子が横方向に拡散するからです。
11 種類のシーケンス型手法を、構造が既知の参照組織で比較した研究（You et al., Nature Methods, 2024）は、この分子の拡散こそが実効解像度を左右する主要な変数だと結論しています。同研究では、嗅球の Slc17a7 について Stereo-seq で顕著な側方拡散が見られた一方、Slide-seq V1.5 と PIXEL-seq では比較的よく抑えられていました。カタログ上の 500 nm が、そのまま 500 nm の分解能を意味するわけではありません。
9. 下流解析で何ができるか
解析単位が定まり、細胞型が割り当たれば、そこから先は「位置情報があるからこそできること」に進みます。
- 空間ドメインの同定：発現の近さと空間の近さの両方を使って、組織の領域を教師なしで切り出す。
- 空間可変遺伝子（SVG）：クラスタに依らず、空間的なパターンを持つ遺伝子を検出する。
- ニッチ・近傍解析：どの細胞型がどの細胞型の隣にいるかを統計的に評価する。
- 細胞間コミュニケーション：scRNA-seq のリガンド–受容体解析に、実際に隣接しているかという制約を加える。
- パスウェイ・転写因子活性：エンリッチメント解析を空間の単位ごとに行う。
- 空間 CNV・腫瘍微小環境：CNV 推定を組織の座標上で行い、腫瘍の領域を分ける。
- 複数スライスの統合と 3D 再構成：連続切片を並べ、立体として復元する。
- 組織画像からの発現予測：H&E 画像だけから発現を推定するモデル。
- 空間の基盤モデル：大規模事前学習をこの分野に持ち込む試み。
10. 環境構築と読み込み
Python 側の構成はこれで足ります。SpatialData（Marconato et al., Nature Methods, 2025）が各社の出力を統一的に読み、Squidpy（Palla et al., Nature Methods, 2022）が空間近傍グラフと空間統計を担当し、Scanpy が通常の単一細胞解析の部分を引き受けます。
bash
# シーケンス型の解析に必要な最小構成
conda create -n spatial -c conda-forge python=3.11
conda activate spatial
# 読み込み・空間解析の土台
pip install spatialdata spatialdata-io spatialdata-plot squidpy scanpy
# 集約（ビン→細胞）とデコンボリューション
pip install bin2cell cell2location
読み込みは、プラットフォームごとの関数を呼ぶだけです。Visium HD の場合、ビンの大きさごとにテーブルが分かれた状態で入ってきます。
python
import spatialdata_io as sdio
import squidpy as sq
# Visium HD：ビンの大きさごとにテーブルが分かれている
sdata = sdio.visium_hd("data/visium_hd_run")
print(list(sdata))
# ['square_002um', 'square_008um', 'square_016um']
# まずは 8 µm ビンで全体像を見る（実務上のデフォルト）
adata = sdata["square_008um"]
print(adata.shape) # (ビン数, 遺伝子数)
print(adata.obsm["spatial"]) # 各ビンの座標
デコンボリューションの RCTD は R パッケージ（spacexr）が本家です。Seurat も空間データに対応しており、R 中心の解析も十分に成立します。Python と R を混ぜる場合、AnnData と Seurat オブジェクトの相互変換が必要になります。scvi-tools 系のモデル（DestVI など）を使うなら Python 側に寄せたほうが素直です（scvi-tools の全体像）。
11. このトラックの記事
以降の記事は、上の流れをそのまま順番になぞります。
- 前処理：データ読み込みとデータ構造 ／ QC と組織検出 ／ 正規化・次元削減・クラスタリング ／ 解析単位の決め方
- 細胞型の割り当て：デコンボリューションの原理と手法分類 ／ cell2location 実践 ／ 手法比較（CARD・RCTD・Tangram） ／ Curio Seeker と doublet モード ／ Visium HD のビン→細胞再構成 ／ Stereo-seq の bin と cellbin ／ segmentation-free 解析
- 下流解析：空間ドメイン同定 ／ 空間可変遺伝子（SVG） ／ ニッチ・近傍解析 ／ 空間の細胞間コミュニケーション ／ パスウェイ・TF活性 ／ 空間 CNV と腫瘍微小環境
- 統合・発展：複数スライスの統合 ／ スライス整列と 3D 再構成 ／ 組織画像からの発現予測 ／ 空間の基盤モデル
まとめ
- シーケンス型は全転写産物をねらえるが、細胞の境界は測れない。細胞という単位は、あとから計算で作る。
- 「全転写産物」には但し書きがある。プローブ捕捉の世代（Visium CytAssist・HD）はヒト・マウスのタンパク質コード遺伝子に限られる。FFPE を使うか、生物種は何かで、ここが先に決まる。
- 解析で最初に決めるのは解析単位。フィーチャが細胞より大きければデコンボリューション、小さければ集約、同程度ならダブレット分離。
- 解像度は上げられるだけ上げるものではない。カウントが許す範囲で上げる。Stereo-seq なら bin20 あたりの遺伝子数中央値 200 が目安。
- QC の指標は scRNA-seq と同じでも、解釈が違う。低カウント領域は生物学的に正しいことがある。
- 細胞型を決める段階では、ほぼ必ず参照 scRNA-seq が要る。参照の質が上限を決める。
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参考文献
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